單細(xì)胞研究精選(九篇)
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第1篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)來(lái)生產(chǎn)重組蛋白技術(shù)已成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一,并以其研究的深入和進(jìn)展推動(dòng)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展。專(zhuān)家預(yù)言:蛋白治療藥物如糖蛋白,抗體和多肽藥物僅僅只是開(kāi)始進(jìn)入市場(chǎng),預(yù)計(jì)在下一個(gè)10 年或20 年會(huì)有一個(gè)更為快速的發(fā)展。蛋白治療藥物的迅速增長(zhǎng)和市場(chǎng)需求已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目前全世界的生產(chǎn)能力。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白中，開(kāi)始常用的細(xì)胞系有CHO和HEK293兩大類(lèi)細(xì)胞。使用較多的COS細(xì)胞，由于其強(qiáng)烈的貼壁作用，曾經(jīng)限制了大規(guī)模懸浮細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，CHO細(xì)胞可以貼壁培養(yǎng)，也可以經(jīng)過(guò)馴化懸浮培養(yǎng)，是生產(chǎn)包括基因工程抗體藥物（人源化或人源抗體）在內(nèi)的重組糖蛋白的首選工具細(xì)胞。HEK293細(xì)胞主要用于蛋白瞬時(shí)表達(dá)及腺病毒生產(chǎn)，尚未見(jiàn)以HEK293表達(dá)的藥物獲得批準(zhǔn)。目前，正在進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)的研發(fā)中的哺乳動(dòng)物細(xì)胞株還有猿細(xì)胞衍生的Vero，Vero細(xì)胞是依賴(lài)于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，主要用于病毒疫苗的生產(chǎn)；SP2/0和NS0主要用于制備雜交瘤細(xì)胞，生產(chǎn)鼠單抗，也有用來(lái)生產(chǎn)人源化單抗的報(bào)道；以及人的胚胎干細(xì)胞等。
建立和優(yōu)化高效的表達(dá)載體系統(tǒng)是重組蛋白在哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)的關(guān)鍵，是抗體產(chǎn)業(yè)化的前提和瓶頸，是提高重組蛋白在單細(xì)胞中的表達(dá)量的基礎(chǔ)。人工構(gòu)建的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體為穿梭載體，含有原核基因序列：大腸桿菌復(fù)制子及抗生素抗性基因等，這樣便于載體在原核細(xì)胞中擴(kuò)增和大量制備。另外含有能使外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子元件，以及終止子和加polyA信號(hào)序列。目前常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)主要有二氫葉酸還原酶基因擴(kuò)增系統(tǒng)及GS基因拷貝擴(kuò)增系統(tǒng)，但是這兩種擴(kuò)增系統(tǒng)所需時(shí)間為6~12個(gè)月，蛋白的表達(dá)不能在早期得以預(yù)測(cè)，是此表達(dá)系統(tǒng)的限速步驟。造成限速的原因是由于基因的沉默現(xiàn)象產(chǎn)生了特定基因的轉(zhuǎn)錄降低或取消。導(dǎo)致基因沉默的主要原因是目的基因所插入位點(diǎn)染色體的結(jié)構(gòu)。異染色質(zhì)區(qū)DNA較濃縮，轉(zhuǎn)錄不活躍，而常染色區(qū)較松馳，轉(zhuǎn)錄活躍。國(guó)外最近一直在發(fā)展一次性表達(dá)的技術(shù)，以此來(lái)達(dá)到提速和優(yōu)化的目的，方式一是通過(guò)在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的修飾改構(gòu)，如MARS、STARS和UCOS等序列的添加；方式二是通過(guò)篩選標(biāo)記基因的弱化來(lái)提高表達(dá)量；方式三是通過(guò)定點(diǎn)整合的方式來(lái)提高表達(dá)量。
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中，主要目的是提高產(chǎn)物的產(chǎn)量和質(zhì)量。絕大數(shù)是在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的哺乳動(dòng)物單細(xì)胞培養(yǎng)都是懸浮式培養(yǎng)，具體來(lái)講就是要提高細(xì)胞密度和產(chǎn)物濃度，降低培養(yǎng)基成本與過(guò)程運(yùn)行成本，同時(shí)滿(mǎn)足產(chǎn)品質(zhì)量要求和安全性要求。當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)研究主要集中在技術(shù)優(yōu)化方面，包括發(fā)展高通量細(xì)胞克隆技術(shù)篩選高表達(dá)細(xì)胞株，進(jìn)行細(xì)胞馴化改變細(xì)胞的生長(zhǎng)方式及生長(zhǎng)環(huán)境，針對(duì)特定細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，針對(duì)特定細(xì)胞與產(chǎn)品的過(guò)程優(yōu)化等，這些都是提高細(xì)胞密度與產(chǎn)物濃度的有力途徑。以培養(yǎng)基是否添加血清成分，可以分為血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基。血清的成分和作用復(fù)雜，同時(shí)存在價(jià)格昂貴、血清成分不明確、批間差異大、存在潛在污染等缺點(diǎn)，使培養(yǎng)過(guò)程具有不可控制性，同時(shí)血清的使用也給蛋白純化帶來(lái)困難。因此，盡管血清培養(yǎng)基適用于大多數(shù)細(xì)胞的培養(yǎng)，血清培養(yǎng)及動(dòng)物來(lái)源成分培養(yǎng)已經(jīng)逐漸被FDA等藥物管理部門(mén)限制。無(wú)血清培養(yǎng)始于二十世紀(jì)六、七十年代，現(xiàn)已有各種商業(yè)化無(wú)血清培養(yǎng)基或針對(duì)特定細(xì)胞的工業(yè)用無(wú)血清培養(yǎng)基用于細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)。成分明確、無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分或無(wú)蛋白培養(yǎng)基用于工業(yè)生產(chǎn)可以有效降低培養(yǎng)及下游純化成本、提高過(guò)程穩(wěn)定性、同時(shí)避免了外源生物污染，更容易被FDA等藥物監(jiān)管部門(mén)批準(zhǔn)。而化學(xué)成分明確的培養(yǎng)基更易于對(duì)細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)需求進(jìn)行研究，使得過(guò)程優(yōu)化工作更加容易進(jìn)行。因此無(wú)血清無(wú)動(dòng)物來(lái)源成分或無(wú)蛋白培養(yǎng)基是大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的主要原料取向。細(xì)胞馴化的實(shí)質(zhì)是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行條件篩選的過(guò)程，其目的是通過(guò)改變細(xì)胞的生長(zhǎng)方式和生活環(huán)境以適應(yīng)特定的工業(yè)化需要。根據(jù)不同需要可以對(duì)工程細(xì)胞進(jìn)行各種馴化：如貼壁的CHO細(xì)胞有懸浮生長(zhǎng)的傾向，可以進(jìn)行由貼壁生長(zhǎng)到懸浮生長(zhǎng)的馴化，血清培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)過(guò)馴化可以無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)馴化工程細(xì)胞可以提高對(duì)NH4+等有毒代謝物的耐受力，延長(zhǎng)培養(yǎng)維持時(shí)間，提高產(chǎn)物濃度。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的流加工藝從二十世紀(jì)九十年代開(kāi)始，日趨成熟，其目的是為了避免培養(yǎng)過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)限制和有毒副產(chǎn)品積累，使細(xì)胞生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)和理化環(huán)境盡可能長(zhǎng)地保持穩(wěn)定，提高細(xì)胞密度和維持時(shí)間，從而提高產(chǎn)物濃度。
目前世界上大約有60%以上的重組蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備的蛋白質(zhì)藥物質(zhì)量高,它們與天然蛋白質(zhì)具有相似的理化性質(zhì)和生物學(xué)功能。隨著對(duì)基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)不斷深入研究，人們對(duì)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞的生理、生化有了更深入的了解。通過(guò)對(duì)生產(chǎn)藥用蛋白的哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、培養(yǎng)、生產(chǎn)技術(shù)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)上進(jìn)行不斷優(yōu)化,從而達(dá)到高效、安全、經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)模式的核心生產(chǎn)技術(shù)。
第2篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
[關(guān)鍵詞] 丹參酮ⅡA；肝癌細(xì)胞；HepG2；凋亡
[中圖分類(lèi)號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）08-0004-03
惡性腫瘤嚴(yán)重危害著人們的健康和生命。隨著環(huán)境的惡化、人們工作生活壓力的增加，惡性腫瘤的發(fā)病率逐年上升。惡性腫瘤的發(fā)病與細(xì)胞的增殖和凋亡異常有密切關(guān)系。肝癌是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率較高，僅次于胃癌[1]。臨床上的治療方法主要有手術(shù)、放療和化療，但每種治療方法都有較大的不良反應(yīng)。近年來(lái)生物療法逐漸引起臨床醫(yī)生的重視，其具有副作用小、療效高、避免正常細(xì)胞免受損傷的優(yōu)勢(shì)。丹參酮ⅡA可以增強(qiáng)細(xì)胞Caspase-3的活性，抑制細(xì)胞的癌基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。目前國(guó)外有關(guān)丹參對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞有抑制作用的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，但關(guān)于丹參酮ⅡA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的作用的報(bào)道還比較少。本文主要是研究丹參酮ⅡA對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用以及對(duì)其凋亡的誘導(dǎo)作用?，F(xiàn)報(bào)道如下。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
肝癌細(xì)胞株HepG2購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。丹參酮ⅡA由西安鴻生生物技術(shù)有限公司提供。
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) （1）肝癌細(xì)胞HepG2復(fù)蘇，將細(xì)胞置入30℃～40℃水浴中迅速溶解，移至培養(yǎng)瓶，添加培養(yǎng)液到5 mL。培養(yǎng)條件37℃，5%CO2濕度飽和。每48 h換液一次，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%～80%時(shí)進(jìn)行傳代。（2）細(xì)胞傳代：取出細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次。加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細(xì)胞，30 s后加血清的DMEM培養(yǎng)液，分裝其他培養(yǎng)瓶，并補(bǔ)充培養(yǎng)液。（3）將培養(yǎng)好的細(xì)胞進(jìn)行凍存。取出培養(yǎng)好的細(xì)胞，倒去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶1～2 mL，覆蓋細(xì)胞，30 s后加細(xì)胞凍存液，分裝至凍存管。4℃凍存10 min，-20℃凍存30 min，-70℃保存。
1.2.2 藥物處理 無(wú)水乙醇溶解丹參酮ⅡA，配成2.0 mg/mL備用。將含有10%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋?zhuān)卜譃?個(gè)濃度：0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL；0 μg/mL為對(duì)照組。
1.3觀察指標(biāo)
1.3.1 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的抑制 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝細(xì)胞HepG2 PBS緩沖液洗滌3次，加入0.2%的胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液，濃度為1×105個(gè)/mL。將單細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔接種100 μL，培養(yǎng)24 h后換含藥的培養(yǎng)液?？瞻捉M為不含細(xì)胞只含培養(yǎng)液；陰性對(duì)照組為含0 μg/mL丹參酮ⅡA；實(shí)驗(yàn)組為5個(gè)不同濃度丹參酮ⅡA。每組共重復(fù)8孔，分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。然后棄去培養(yǎng)液，加入20 μL新鮮MTT液，培養(yǎng)4 h候棄去培養(yǎng)液。每孔加入120 μL DMSO，震蕩至結(jié)晶完全溶解，使用酶標(biāo)儀在490 nm處讀取吸光度值（A），共重復(fù)3次。細(xì)胞抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值）×100%。
1.3.2檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡情況 收集不同濃度丹參酮ⅡA處理過(guò)的細(xì)胞1×105個(gè)，離心后棄上清液，PBS緩沖液洗滌3次，緩慢加入70%乙醇1mL，4℃下保存過(guò)夜。取出后離心去除固定液，PBS緩沖液洗滌3次，加1.0 mg/mL的RnaseA 200 μL，37℃下水浴30 min，加PI 800 μL染色液，避光，4℃保存30 min，進(jìn)行檢測(cè)。采用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD流式細(xì)胞儀）進(jìn)行檢測(cè)，采用分析軟件計(jì)算凋亡率和各凋亡周期的比例。熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的凋亡形態(tài)。
1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間的比較采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2 結(jié)果
2.1 丹參酮ⅡA對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的抑制作用
相同的濃度，隨著時(shí)間延長(zhǎng)吸光度逐漸下降，而同一時(shí)間，隨著濃度的增加吸光度也逐漸下降。見(jiàn)表1。相同濃度，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，丹參酮ⅡA對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的抑制率逐漸增加；相同時(shí)間，隨著濃度的增加，丹參酮ⅡA對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2生長(zhǎng)的抑制率也逐漸增加。見(jiàn)圖1、2。
2.2細(xì)胞周期分布和凋亡率
搜集丹參酮ⅡA作用72 h的細(xì)胞，觀察細(xì)胞周期，可見(jiàn)隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，G0/G1的比例逐漸升高（2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL），與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。隨著丹參酮ⅡA濃度（0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL）的增加，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表2。熒光顯微鏡下的細(xì)胞凋亡形態(tài)見(jiàn)圖3、4。
3 討論
原發(fā)性肝癌是臨床上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前針對(duì)肝癌的治療方法較多，涉及到多個(gè)學(xué)科的共同協(xié)作，如能得到正確合理的治療，肝癌遠(yuǎn)期療效還是比較理想的。目前臨床上的治療方法主要有手術(shù)、化療、放療等。手術(shù)治療對(duì)患者本身也是一種創(chuàng)傷，而化療和放療均對(duì)患者有較大的副作用。因此，了解腫瘤發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找效果好、副作用小的治療方法成為臨床的熱點(diǎn)。目前生物療法，包括免疫療法等逐漸在臨床上廣泛應(yīng)用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞的異常增殖和凋亡有關(guān)。1972年Kerr等三位科學(xué)家首次提出了細(xì)胞凋亡的概念。細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的死亡。細(xì)胞凋亡與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是被動(dòng)的過(guò)程，而是主動(dòng)過(guò)程，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等作用，它并不是病理?xiàng)l件下自體損傷的現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)爭(zhēng)取的一種死亡過(guò)程。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種基本生物學(xué)現(xiàn)象，在多細(xì)胞生物去除不需要的或異常的細(xì)胞中十分必要。凋亡是多基因嚴(yán)格控制的過(guò)程，這些基因在種屬之間非常保守。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種凋亡抑制分子，包括P35、CrmA、IAPs、FLIPs以及Bcl-2家族的凋亡抑制分子。
丹參酮ⅡA為唇形科植物丹參（salvia miltiorrhza）中分離的二萜醌類(lèi)化合物，臨床應(yīng)用廣泛[3-6]，能夠改善冠狀動(dòng)脈循環(huán)，抑制血栓疾病發(fā)生，具有顯著擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠脈血流量、降低心肌耗氧量、減慢心率和增加心肌收縮力的作用。丹參素及丹參酮IIA均能顯著延長(zhǎng)小鼠耐缺氧時(shí)間，減輕缺氧引起的心肌損傷，同時(shí)，改善心肌收縮力，促進(jìn)心肌再生，具有抗氧化作用，可防止LDL的氧化，從而保護(hù)EC，維持其分泌PGL2的正常功能，抗AS形成。研究報(bào)道，丹參酮對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用。吳俊偉[7]研究丹參酮ⅡA抑制人食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及機(jī)制，結(jié)果顯示其對(duì)Eca-1-9細(xì)胞的增殖具有抑制作用，丹參酮ⅡA濃度在1 μg/mL及以上濃度抑制作用明顯，并隨著濃度升高抑制作用增強(qiáng)。不同濃度的丹參酮ⅡA處理過(guò)Eca-1-9細(xì)胞后，抑制細(xì)胞凋亡的基因Bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯下降。鐘志宏等[8]研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用具有明顯的時(shí)間和劑量依賴(lài)性。熒光染色可以觀察典型的凋亡細(xì)胞形態(tài)特征，瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)明顯的凋亡細(xì)胞形成的梯狀條帶，作用72 h后，隨著濃度的增加細(xì)胞的凋亡率也逐漸增加。江城鋒等[9]研究結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA及其衍生物對(duì)Hela細(xì)胞的增殖具有抑制作用，對(duì)丹參酮ⅡA進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，能夠增強(qiáng)其抑制作用。
MTT全稱(chēng)為3-（4，5-Dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，漢語(yǔ)化學(xué)名為 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽，主要用于細(xì)胞增殖及細(xì)胞活性測(cè)定。1983年由Mosmann等[10]首先報(bào)道用MTT比色法測(cè)定細(xì)胞活性劑抗癌藥物對(duì)細(xì)胞增殖、活性效應(yīng)。檢測(cè)原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無(wú)此功能[11]。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲臜，用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其光吸收值，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。根據(jù)測(cè)得的吸光度值（OD值），來(lái)判斷活細(xì)胞數(shù)量，OD值越大細(xì)胞活性越強(qiáng)（如果是測(cè)藥物毒性，則表示藥物毒性越小）。本文采用MTT方法檢測(cè)丹參酮ⅡA對(duì)肝細(xì)胞癌HepG2的生長(zhǎng)抑制作用。結(jié)果顯示，相同濃度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，吸光度逐漸下降，而相同時(shí)間，隨著濃度的升高吸光度也逐漸下降。說(shuō)明丹參酮ⅡA對(duì)肝細(xì)胞癌HepG2的生長(zhǎng)抑制作用具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。0.5 μg/mL的濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用不明顯。對(duì)作用72 h的細(xì)胞檢測(cè)不同細(xì)胞周期所占比例，發(fā)現(xiàn)隨著濃度增加，G0/G1期的細(xì)胞比例逐漸增加。G0期是細(xì)胞休眠期，而G1期是從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期，又稱(chēng)合成前期。G0/G1期細(xì)胞的上升，S期細(xì)胞的下降提示丹參酮ⅡA抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，也在誘導(dǎo)細(xì)胞向正常細(xì)胞分化。對(duì)凋亡率的檢測(cè)顯示，隨著濃度的升高，細(xì)胞的凋亡率逐漸升高，說(shuō)明丹參酮ⅡA能有誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌HepG2的凋亡，并且具有濃度依賴(lài)效應(yīng)。
綜上所述，丹參酮ⅡA作為中藥的提取物，在臨床的應(yīng)用廣泛。其對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)具有抑制作用，并且具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性，對(duì)凋亡的誘導(dǎo)作用具有濃度依賴(lài)性。
[參考文獻(xiàn)]
[1] 汪福昌，郭武華. 肝細(xì)胞癌生物標(biāo)志物研究進(jìn)展[J]. 山東醫(yī)藥，2012， 52（42）：87-89.
[2] 袁淑蘭. 丹參酮ⅡA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡分子機(jī)制[D]. 四川大學(xué)：2004.
[3] 趙興瓊. 丹參酮ⅡA磺酸鈉、川芎嗪配合西藥治療心肌缺血臨床效果觀察[J]. 大眾健康：理論版，2012，（10）：173-174.
[4] 馬麗虹，李冬梅，李可建. 丹參酮ⅡA治療缺血性卒中急性期療效評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（11）：1510-1512.
[5] 于陳寶，范建生，張傳明，等. 曲美他嗪聯(lián)合丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液在慢性心力衰竭患者治療中的療效研究[J]. 中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2012， 1（20）：51-52.
[6] 馬麗虹，李冬梅，李可建. 丹參酮ⅡA治療缺血性卒中急性期療效評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，31（11）：1510-1512.
[7] 吳俊偉. 丹參酮ⅡA抑制人食管癌細(xì)胞生長(zhǎng)及機(jī)制研究[M]. 石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2009：19-26.
[8] 鐘志宏，陳文貴，柳永和，等. 丹參酮ⅡA抑制HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)及誘導(dǎo)其凋亡的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中南大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2007，2（1）：99-103.
[9] 江城鋒，李瑞峰，薛丹，等. 丹參酮ⅡA結(jié)構(gòu)修飾及其對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用研究[J]. 天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2012，24（3）：385-388.
[10] Berridge MV，Tan AS. Characterisation of the cellular reduction of 3-（4，5-dimethylthiazol-2yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide （MTT）：Subcellular localization，substrate dependence，and involvement of mitochondrial electron transport in MTT reduction[J]. Archives Biochem Biophys 1993，303：474-482.
[11] Berridge MV，Herst PM，Tan AS. Tetrazolium dyes as tools in cell biology：new insights into their cellular reduction[J]. Biotechnology Annual Review，2005，11：127-152.
第3篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
一、信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行效率的涵義
1．效率的經(jīng)濟(jì)內(nèi)涵
不同經(jīng)濟(jì)學(xué)者對(duì)于“效率”一詞內(nèi)涵的理解并不一致，目前還沒(méi)有一個(gè)明確的含義界定。經(jīng)濟(jì)學(xué)泰斗薩繆爾森在《經(jīng)濟(jì)學(xué)》一書(shū)中，是這樣定義“效率”的：“效率意味著不存在浪費(fèi)，即當(dāng)經(jīng)濟(jì)在不減少一種物品生產(chǎn)的情況下，就不增加另一種物品的生產(chǎn)，它的運(yùn)行便是有效率的”[1]。這時(shí)經(jīng)濟(jì)處于生產(chǎn)可能性邊界之上。國(guó)內(nèi)經(jīng)濟(jì)學(xué)者樊綱、光等在《公有制宏觀經(jīng)濟(jì)理論大綱》中給經(jīng)濟(jì)效率下的定義是“經(jīng)濟(jì)效率是指社會(huì)利用現(xiàn)有資源進(jìn)行生產(chǎn)所提供的效用滿(mǎn)足的程度，因此也可一般地稱(chēng)為資源的利用效率”[2]。它是需要的滿(mǎn)足程度與所耗費(fèi)資源（成本）的對(duì)比關(guān)系。需要明確的是，它不是生產(chǎn)多少產(chǎn)品的簡(jiǎn)單的物量概念，而是一個(gè)效用概念或社會(huì)福利概念。對(duì)于資源配置的效率問(wèn)題，意大利經(jīng)濟(jì)學(xué)家帕累托提出了廣為人知的帕累托效率標(biāo)準(zhǔn)，得到經(jīng)濟(jì)學(xué)界廣泛的認(rèn)可和應(yīng)用。
最常見(jiàn)意義上的“效率”是指投入與產(chǎn)出或成本與收益之間的關(guān)系，也就是指現(xiàn)有生產(chǎn)資源與它們?yōu)槿祟?lèi)所提供的效用之間的對(duì)比關(guān)系。這里指的產(chǎn)出或收益，指的不是任意的物品，而是能夠?yàn)槿藗兲峁M(mǎn)足的有用物品。從經(jīng)濟(jì)的角度看，最終的產(chǎn)出就是人們的滿(mǎn)足即效用。而投入或成本．從一般意義上說(shuō)，是在一定的科學(xué)技術(shù)條件下生產(chǎn)一定產(chǎn)品所需的生產(chǎn)資源，包括勞動(dòng)力資源和物質(zhì)資源。依據(jù)考察主體不同，效率分析具有一定的層次性。當(dāng)效率概念應(yīng)用于個(gè)別企業(yè)的時(shí)候，有其特定的含義，所要研究的問(wèn)題主要是該企業(yè)是否利用一定的生產(chǎn)資源生產(chǎn)出了最大量的產(chǎn)出，或者是否在產(chǎn)出量一定時(shí)實(shí)現(xiàn)了成本最小。這種效率稱(chēng)為技術(shù)效率。就整個(gè)社會(huì)經(jīng)濟(jì)效率而言，它要揭示的就是全部生產(chǎn)資源與所有人的總經(jīng)濟(jì)福利之間的對(duì)比關(guān)系，而在給定各生產(chǎn)單位的技術(shù)效率的前提下研究經(jīng)濟(jì)效率問(wèn)題時(shí)，主要的問(wèn)題在于資源是否在不同生產(chǎn)目的之間得到了合理配置，使其最大限度地滿(mǎn)足了最大部分人們的各種需要。用于分析這一問(wèn)題的概念就是“經(jīng)濟(jì)效率”，也稱(chēng)“配置效率”。
2．信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行效率的涵義
對(duì)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的效率問(wèn)題，目前討論主要集中在信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的運(yùn)行是否有效率上，而對(duì)于其具體的涵義還沒(méi)有一個(gè)明確的界定，更缺乏比較完整的理論體系。盡管不同的學(xué)者對(duì)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的效率有不同的理解，但比較一致的看法是，信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的效率是信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)在業(yè)務(wù)活動(dòng)中投入與產(chǎn)出或成本與收益的對(duì)比關(guān)系。從本質(zhì)上講，信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的效率是指信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)在有效地保證其資產(chǎn)安全的基礎(chǔ)上，能夠合理配置信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的資源并能最大限度地推動(dòng)社會(huì)經(jīng)濟(jì)資源的流動(dòng)，是信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)能力、投入產(chǎn)出能力和可持續(xù)發(fā)展能力的總稱(chēng)。信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的效率可以從微觀和宏觀兩個(gè)方面加以考察。從信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)單個(gè)部門(mén)來(lái)考察，其效率就是指各信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)所完成的金融資源配置達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)，也就是其投入與產(chǎn)出或成本與收益的比較。從宏觀層面來(lái)考察，信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)效率就是信用擔(dān)保制度對(duì)國(guó)民經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)的貢獻(xiàn)率，也就是把信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)要素的投入與國(guó)民經(jīng)濟(jì)的增量和增長(zhǎng)質(zhì)量進(jìn)行比較。
二、信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行效率的度量方法
如何度量信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的運(yùn)行效率，不同的學(xué)者從不同角度來(lái)度量，下面介紹三種效率度量方法，即財(cái)務(wù)比率分析法、成本收益法和投入產(chǎn)出法。
1．財(cái)務(wù)比率分析法
信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的財(cái)務(wù)數(shù)據(jù)一般是比較容易獲取的，所以一些學(xué)者考慮用一些運(yùn)行指標(biāo)來(lái)度量其績(jī)效，并監(jiān)管其日常的運(yùn)行。陳乃醒(2001)建立了由擔(dān)保貸款額相當(dāng)于代償能力的倍數(shù)、每百元擔(dān)保貸款占用擔(dān)保基金額、代償率、擔(dān)保貸款的經(jīng)營(yíng)費(fèi)用占用率、擔(dān)保貸款的總成本占用率、盈利額、破產(chǎn)臨界點(diǎn)、擔(dān)?；鹄麧?rùn)率等8個(gè)指標(biāo)構(gòu)成的信用擔(dān)保的經(jīng)濟(jì)效益的評(píng)價(jià)指標(biāo)體系[3]。梅保平(2004)從信用擴(kuò)張、風(fēng)險(xiǎn)控制、風(fēng)險(xiǎn)分散、持續(xù)發(fā)展等方面建立了信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的運(yùn)行能力評(píng)價(jià)指標(biāo)體系[4]。放大倍數(shù)是一個(gè)重要的財(cái)務(wù)指標(biāo)，放大倍數(shù)為擔(dān)保余額與擔(dān)保機(jī)構(gòu)總資本金的比例，放大倍數(shù)越高，擔(dān)保基金的成效就越大，但其范圍總要控制在最大放大倍數(shù)之內(nèi)，并且受相關(guān)因素的影響。陳曉紅、謝曉光(2005)通過(guò)模型分析得出，擔(dān)保機(jī)構(gòu)對(duì)企業(yè)的調(diào)查監(jiān)控成本、反擔(dān)?？刂颇芰豌y行對(duì)擔(dān)保機(jī)構(gòu)的監(jiān)控成本是決定擔(dān)保放大倍數(shù)的關(guān)鍵因素并由此認(rèn)為互擔(dān)保在提高擔(dān)保放大倍數(shù)方面具備一定優(yōu)勢(shì)[5]。林毅(2006)以財(cái)務(wù)比率分析法為基礎(chǔ)，參照國(guó)內(nèi)學(xué)者任永乎、梅強(qiáng)(2002)等人的研究從擔(dān)保機(jī)構(gòu)的角度來(lái)衡量信用擔(dān)保體系的運(yùn)行績(jī)效，分析的結(jié)果表明我國(guó)擔(dān)保機(jī)構(gòu)整體的效率比較低，其外部的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益也沒(méi)有充分地發(fā)揮出來(lái)[6-7]。
信用擔(dān)保計(jì)劃的成敗與違約率直接相關(guān)，但是違約率的衡量也是個(gè)權(quán)衡取舍的問(wèn)題，零擔(dān)保率雖然可以確保零違約率，擔(dān)保機(jī)構(gòu)的資產(chǎn)安全性也可以得到保障，但也意味著擔(dān)保機(jī)構(gòu)的無(wú)效性和不作為。大量的實(shí)證檢驗(yàn)也表明較高的違約率和較高的金融附加量是相關(guān)的，違約率應(yīng)該維持在一定限度內(nèi)，超過(guò)這一限度會(huì)不可避免地導(dǎo)致?lián)C(jī)構(gòu)的破產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。加拿大學(xué)者賴(lài)丁和海恩斯(Riding&Haines，2001)構(gòu)建了一個(gè)模型，以加拿大的SBLA（小企業(yè)貸款管理局）貸款項(xiàng)目為基礎(chǔ)從貸款銀行的期望收益角度對(duì)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的違約率進(jìn)行了測(cè)量[8]。
需要注意的是在應(yīng)用財(cái)務(wù)比率法時(shí)要盡量避免以偏概全，要權(quán)衡各方面得失。不僅要考慮信用擔(dān)保計(jì)劃所覆蓋的范圍，又要認(rèn)識(shí)到其可能面臨的風(fēng)險(xiǎn)。盡可能地發(fā)掘信用擔(dān)保更多的技術(shù)指標(biāo)，以有效地衡量和監(jiān)管其日常的運(yùn)行。
2．成本收益法
用成本收益法來(lái)衡量信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的效率，關(guān)鍵在于如何確定成本和收益，但是實(shí)踐操作中要準(zhǔn)確地確定其成本和收益卻面臨眾多困難。一方面數(shù)據(jù)的來(lái)源是個(gè)問(wèn)題；另一方面，有時(shí)即使數(shù)據(jù)準(zhǔn)確無(wú)誤，在不同的經(jīng)濟(jì)環(huán)境下用它們來(lái)解釋信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的效率還是會(huì)引起很大爭(zhēng)議。以下是學(xué)者們衡量時(shí)常用的指標(biāo)和方法。
(1)成本
信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的成本主要包括啟動(dòng)成本、維持成本、交易成本，交易成本又包括運(yùn)行成本和違約代償成本。啟動(dòng)成本包括投入的資本金以及建立相應(yīng)機(jī)構(gòu)、雇傭人員、對(duì)工作人員進(jìn)行教育培訓(xùn)和對(duì)外宣傳等相關(guān)費(fèi)用。維持成本是指持續(xù)的政府補(bǔ)貼或外部融資來(lái)解決貸款代償后的擔(dān)保基金缺口。運(yùn)行成本是指經(jīng)營(yíng)過(guò)程中的正常運(yùn)轉(zhuǎn)管理費(fèi)用、學(xué)習(xí)費(fèi)用和維持準(zhǔn)備金比率的風(fēng)險(xiǎn)準(zhǔn)備。違約代償成本是指當(dāng)借款方違約時(shí)擔(dān)保機(jī)構(gòu)向金融機(jī)構(gòu)代償?shù)慕痤~。啟動(dòng)成本和維持成本一般比較容易測(cè)量。學(xué)者們往往著重于衡量擔(dān)保計(jì)劃的交易成本，即運(yùn)營(yíng)成本和違約代償成本。例如，DavidCanuno和ClaraCradone(1999)提出了一個(gè)評(píng)估模型，較好地測(cè)量了西班牙的LGA(貸款擔(dān)保協(xié)會(huì))的交易成本，他們的論文中就沒(méi)有過(guò)多地考慮啟動(dòng)成本和維持成本而將重點(diǎn)放在交易成本上。
(2)收益
信用擔(dān)保計(jì)劃所帶來(lái)的收益主要集中表現(xiàn)在金融附加量上。所謂金融附加量，是指通過(guò)執(zhí)行信用擔(dān)保計(jì)劃使得目標(biāo)群體從金融機(jī)構(gòu)獲得的貸款額度增加或貸款條件改善。能否產(chǎn)生金融附加量是判斷信用擔(dān)保計(jì)劃執(zhí)行收益的核心標(biāo)準(zhǔn)。如果沒(méi)有金融附加量，則信用擔(dān)保計(jì)劃就沒(méi)有收益可言。金融附加量主要包含以下幾個(gè)方面的內(nèi)容：貸款額度增加、貸款期限延長(zhǎng)、貸款費(fèi)率減少、抵押比例降低、貸款流程加快等（龔瑾瑜和韓剛，2006）[lo]。同時(shí)，信用擔(dān)保計(jì)劃的執(zhí)行還會(huì)產(chǎn)生派生收益即經(jīng)濟(jì)附加量。經(jīng)濟(jì)附加量是指由于信用擔(dān)保計(jì)劃的支持，目標(biāo)群體獲得了更多的貸款額度或更有利的貸款條件，并由此使其市場(chǎng)機(jī)會(huì)增多，而新增加的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)。經(jīng)濟(jì)附加量用來(lái)衡量信用擔(dān)保對(duì)整個(gè)經(jīng)濟(jì)的貢獻(xiàn)度。
Boocock和Sheriff(1996)運(yùn)用了上述金融附加量指標(biāo)對(duì)馬來(lái)西亞信用擔(dān)保公司的NGPS項(xiàng)目進(jìn)行了評(píng)估，結(jié)果表明90%的借款者在沒(méi)有NFUDES擔(dān)保的情況下不能獲取正常的貸款。后來(lái)Boocock還通過(guò)調(diào)查問(wèn)卷的形式進(jìn)一步研究，調(diào)查的結(jié)果表明在所調(diào)查的32家企業(yè)中63%的擔(dān)保貸款是額外提供的，而不是其他金融貸款形式的替代品。加拿大學(xué)者賴(lài)丁和海恩斯(Riding＆Haines)對(duì)3000戶(hù)接受SBIA貸款的中小企業(yè)作了隨機(jī)調(diào)查，根據(jù)粗略計(jì)算，每創(chuàng)造一個(gè)就業(yè)崗位需要耗費(fèi)SBLA小額貸款擔(dān)保成本不到l000加元，大額貸款擔(dān)保成本不到3000加元，平均成本約為2000加元。從成本收益來(lái)比較．SBIA貸款在創(chuàng)造就業(yè)機(jī)會(huì)上的效率極高。對(duì)于這些數(shù)據(jù)的可靠性，有些學(xué)者表示了懷疑，但是信用擔(dān)保計(jì)劃增加對(duì)目標(biāo)群體的貸款量這點(diǎn)是毫無(wú)疑問(wèn)的，只是我們需要進(jìn)一步地細(xì)化其衡量的指標(biāo)和方法。
3．投入產(chǎn)出法
投入產(chǎn)出法用來(lái)評(píng)價(jià)效率主要有參數(shù)法和非參數(shù)法。參數(shù)法在測(cè)度信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)效率時(shí)，需要規(guī)定效率前沿函數(shù)的具體形式，并通過(guò)樣本信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)估算出效率前沿函數(shù)中的各個(gè)參數(shù)。參數(shù)法大致可以分為隨機(jī)前沿法(stochasticFrontierap-proach，SFA)、自由分布法(distribu-tion-freeapproachDFA)，厚前沿分布法(thick-frontierapproachTEA)和遞歸厚前沿法(recursivethick-frontierapproachRTFA)等。這種方法有兩個(gè)缺陷：其一，函數(shù)形式需事先假定；其二，參數(shù)估計(jì)的有效性和合理性需要檢驗(yàn)，參數(shù)的檢驗(yàn)需要關(guān)注統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的有效性和經(jīng)濟(jì)含義的有效性。
非參數(shù)法對(duì)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)效率進(jìn)行測(cè)度時(shí)，不必估算效率前沿函數(shù)中的參數(shù)及規(guī)定函數(shù)的具體形式。非參數(shù)方法主要指數(shù)據(jù)包絡(luò)分析法。數(shù)據(jù)包絡(luò)分析(dateenvelopmentanaly-sis)簡(jiǎn)稱(chēng)DEA，是數(shù)學(xué)、運(yùn)籌學(xué)、數(shù)理經(jīng)濟(jì)學(xué)和管理科學(xué)的一個(gè)新的交叉領(lǐng)域。它摒棄了參數(shù)方法研究中的弱點(diǎn)，不去尋求生產(chǎn)前沿面的具體形式，而是通過(guò)所觀測(cè)的大量實(shí)際數(shù)據(jù)基于一定的生產(chǎn)有效性標(biāo)準(zhǔn)找出位于生產(chǎn)前沿面上的相對(duì)有效點(diǎn)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于：①無(wú)需知道生產(chǎn)函數(shù)的具體形式，在研究中受到的約束較少；②經(jīng)濟(jì)生活是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展的過(guò)程，測(cè)度相對(duì)效率的意義將是更為深遠(yuǎn)的。
Hway-BoonOng,MuzafarShahHabibullah,AliasRadma,M.Azali(2003)等人，運(yùn)用數(shù)據(jù)包絡(luò)分析法(DEA)對(duì)馬來(lái)西亞的信貸擔(dān)保公司(CGC)的技術(shù)效率、純技術(shù)效率和規(guī)模效率進(jìn)行研究。他們運(yùn)用CGC的歷史面板數(shù)據(jù)，將由CGC所同意的擔(dān)保貸款作為產(chǎn)出量，將CCC的固定資產(chǎn)、經(jīng)營(yíng)費(fèi)用和租賃房屋費(fèi)用作為投入量，他們的研究結(jié)論表明馬來(lái)西亞的信貸擔(dān)保公司總體技術(shù)效率是比較低的，因此他們建議應(yīng)當(dāng)考慮重新配置已有的資源、避免浪費(fèi)以增加純技術(shù)效率。并且應(yīng)該降低其對(duì)中小企業(yè)擔(dān)保的要求，為中小企業(yè)提供更多擔(dān)保，以提高其規(guī)模效率。
三、信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行效率度置的現(xiàn)實(shí)約束
盡管?chē)?guó)外很多學(xué)者針對(duì)信用擔(dān)保計(jì)劃的執(zhí)行效率從不同的方法和不同的角度進(jìn)行了實(shí)證研究，國(guó)內(nèi)官方近年來(lái)的信用擔(dān)保發(fā)展報(bào)告也使用以上方法中的一些指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)我國(guó)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的運(yùn)行效率，但是目前為止仍然難找到令人信服的信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行效率的評(píng)價(jià)報(bào)告。這主要是因?yàn)樵趯?shí)際經(jīng)濟(jì)運(yùn)行中，對(duì)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行效率的度量遠(yuǎn)比對(duì)其內(nèi)容和結(jié)構(gòu)的分析判斷要困難得多。主要面臨以下幾方面的約束：
1．基礎(chǔ)數(shù)據(jù)來(lái)源與準(zhǔn)確性方面的約束
在世界范圈內(nèi)，從信用擔(dān)保計(jì)劃產(chǎn)生至今已經(jīng)有七八十年的歷史．國(guó)外的統(tǒng)計(jì)機(jī)構(gòu)對(duì)于信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的運(yùn)營(yíng)大都有一套完整的統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)，這就為其運(yùn)行效率的實(shí)證分析提供了基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)來(lái)源。但是并不是所有的實(shí)證研究數(shù)據(jù)都能從統(tǒng)計(jì)系統(tǒng)獲?。纾杀臼找娣ㄖ械慕灰壮杀?、金融附加量中的指標(biāo)諸如貸款期限延長(zhǎng)、貸款費(fèi)率減少、抵押比例降低、貸款流程加快等。經(jīng)濟(jì)附加量指標(biāo)：新增加的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)即便有數(shù)據(jù)來(lái)源其準(zhǔn)確性也因種種原因而受質(zhì)疑，例如信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)為獲取政府補(bǔ)貼在上報(bào)數(shù)據(jù)時(shí)往往夸大數(shù)據(jù)或虛報(bào)數(shù)據(jù)。為了研究需要通過(guò)對(duì)借款人和貸款人進(jìn)行問(wèn)卷或訪談?wù){(diào)查的辦法，但是這種主觀調(diào)查方法本身有兩個(gè)局限性：一是樣本通常較小，誤差很大；二是容易受到“霍索恩效應(yīng)(HawthorneEffect)”的影響，即被調(diào)查人很可能做出他們認(rèn)為調(diào)查人希望聽(tīng)到的回答。
我國(guó)信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的發(fā)展也就十幾年的歷史，農(nóng)村信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的發(fā)展歷史則更短，主要是這幾年的事，很多地區(qū)對(duì)于信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)的經(jīng)營(yíng)情況不列入統(tǒng)計(jì)的范圍，基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)缺乏這就在一定程度上限制了對(duì)其實(shí)證研究的展開(kāi)。這也是我國(guó)學(xué)者在研究信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)問(wèn)題時(shí)理論說(shuō)得多而實(shí)證研究缺乏的原因。
2．替代問(wèn)題的約束
擔(dān)保貸款的規(guī)模、擔(dān)保企業(yè)個(gè)數(shù)和擔(dān)保筆數(shù)等指標(biāo)，常常被引用來(lái)說(shuō)明信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行效果，但是由于替代問(wèn)題的存在，這些指標(biāo)并不能精準(zhǔn)地度量金融附加量。信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)運(yùn)行過(guò)程中可能遇到的替代問(wèn)題有兩種：一種是貸款方式替代問(wèn)題；另一種是貸款機(jī)構(gòu)替代問(wèn)題。
(1)貸款方式替代。這是發(fā)生在與信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)合作的金融機(jī)構(gòu)內(nèi)部的貸款方式替代問(wèn)題。合作的金融機(jī)構(gòu)并沒(méi)有增加新的貸款客戶(hù)，是從已經(jīng)建立貸款關(guān)系的客戶(hù)群體中篩選出部分客戶(hù)納入信用擔(dān)保計(jì)劃的范圍，在貸款操作上僅僅是對(duì)該部分客戶(hù)的貸款方式作一個(gè)變更，例如，從原來(lái)的抵押擔(dān)保貸款變更為信用擔(dān)保貸款，客戶(hù)群體和貸款額度都沒(méi)有因?yàn)樾庞脫?dān)保機(jī)構(gòu)的加入而增加。這種替代主要發(fā)生在合作的金融機(jī)構(gòu)認(rèn)為信用擔(dān)保計(jì)劃并不能增加其利潤(rùn)的情況下；并且合作的金融機(jī)構(gòu)為了轉(zhuǎn)移和規(guī)避信貸風(fēng)險(xiǎn)，會(huì)將原有客戶(hù)群體中風(fēng)險(xiǎn)最高的那部分轉(zhuǎn)入信用擔(dān)保計(jì)劃的范圍。
(2)貸款機(jī)構(gòu)替代。這是發(fā)生在貸款人之間的替代問(wèn)題。拿農(nóng)村信用擔(dān)保來(lái)說(shuō)，農(nóng)村信用擔(dān)保計(jì)劃的執(zhí)行并沒(méi)有使得某個(gè)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)體中的農(nóng)戶(hù)和農(nóng)村中小企業(yè)獲得更多的貸款支持，而僅僅是貸款機(jī)構(gòu)的變更。貸款機(jī)構(gòu)的替代又可以分為兩種情況：一種是正規(guī)金融機(jī)構(gòu)之間的相互替代：另一種是正規(guī)金融機(jī)構(gòu)與民間金融組織之間的替代，這種替代更易發(fā)生。
3．貢獻(xiàn)模糊的約束
在信用擔(dān)保計(jì)劃執(zhí)行后，即使非常理想地不發(fā)生替代問(wèn)題，也就是金融機(jī)構(gòu)對(duì)納入信用擔(dān)保計(jì)劃范圍的客戶(hù)所投放的擔(dān)保貸款全部是凈增貸款，信用擔(dān)保計(jì)劃收益的度量還會(huì)面臨貢獻(xiàn)模糊問(wèn)題的約束。如前面所述，信用擔(dān)保計(jì)劃收益可用金融附加量（新增貸款額等）和經(jīng)濟(jì)附加量（新增加的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)）來(lái)度量，因而本文所說(shuō)的貢獻(xiàn)模糊是指這樣一種情況：在推行信用擔(dān)保計(jì)劃的過(guò)程中，國(guó)家宏觀經(jīng)濟(jì)、國(guó)家產(chǎn)業(yè)政策、區(qū)域經(jīng)濟(jì)政策、行業(yè)競(jìng)爭(zhēng)狀況、金融體制改革、出口貿(mào)易機(jī)會(huì)、社會(huì)服務(wù)功能等都可能發(fā)生有利于金融機(jī)構(gòu)增加目標(biāo)群體貸款的變化，這些因素都對(duì)金融機(jī)構(gòu)凈增目標(biāo)群體貸款做出了貢獻(xiàn)，從而也為目標(biāo)群體的收入額、利稅額和就業(yè)人數(shù)的增加做出了貢獻(xiàn)，但是各個(gè)貢獻(xiàn)因素的界限是模糊的，無(wú)法將信用擔(dān)保計(jì)劃的貢獻(xiàn)客觀地從這些綜合貢獻(xiàn)因素中剝離出來(lái)，這也約束了信用擔(dān)保計(jì)劃收益的準(zhǔn)確度量?？?/p>
參考文獻(xiàn)(References)
[1]薩繆爾森．經(jīng)濟(jì)學(xué)（第12版）[M]．北京：中國(guó)發(fā)展出版社，1992.
[2]樊綱，光，等，公有制宏觀經(jīng)濟(jì)理論大綱[M]．上海：上海三聯(lián)書(shū)店,1990．
[3]陳乃醒，中小企業(yè)信用擔(dān)保的經(jīng)濟(jì)效益與指標(biāo)體系[J]．經(jīng)濟(jì)管理，2001(7):36-37．
第4篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
Study on the expression of calreticulin in hypertrophic scar-derived fibroblasts
【Abstract】Objective To investigate the expression level and intracellular distribution of calreticulin(CRT) in hypertrophic scar-derived fibroblasts(HSF)and normal skin-derived fibroblasts(NSF).Methods Using anti-CRT antibody， CRT was detected in HSF and NSF by immunocytochemistry and ELISA technique.Results CRT was present in the cytoplasm and nuclei in proliferating HSF or NSF in culture， but HSF possessed significantly higher expression level of CRT than NSF(P＜0.01). When these cells (HSF and NSF) were fused ， neither intracellular nor intranuclear staining for CRT was observed.Conclusion In HSF and NSF，the distribution of CRT is widespread. Because of its abundant expression in HSF， we postulate that CRT as a multifunctional protein plays an important role in Ca2+ sequestering， integrin-mediated signalling and cell adhesion.
【Key words】 Hypertrophic scar Fibroblast Calreticulin Expression
增生性瘢痕(Hypertrophic scar， HS)作為創(chuàng)傷及外科手術(shù)后常見(jiàn)且十分棘手的皮膚組織疾病，瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞異?；罨图?xì)胞外間質(zhì)過(guò)度沉積既是HS的重要組織學(xué)特征，也是HS發(fā)生、發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ)。鈣網(wǎng)蛋白(Calreticulin， CRT)最早是作為一種存在于非肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的主要鈣結(jié)合蛋白得以認(rèn)識(shí)的［1］，近幾年的研究發(fā)現(xiàn)：除具有鈣離子儲(chǔ)藏作用外，CRT在參與并調(diào)節(jié)眾多細(xì)胞生物學(xué)活性功能上有著積極影響［2-5］，同時(shí)它還作為自身抗原在某些免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中有著極其重要的價(jià)值［6］。我們通過(guò)CRT抗體并利用原位ELISA及免疫細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)檢測(cè)瘢痕成纖維細(xì)胞體外表達(dá)CRT水平，輔以正常皮膚成纖維細(xì)胞作對(duì)照，探討CRT在瘢痕成纖維細(xì)胞發(fā)揮異常生物學(xué)活性功能中的作用。
1 材料與方法
1.1 組織標(biāo)本
增生性瘢痕及正常皮膚組織標(biāo)本均取自住院病人，年齡17～40歲?；颊咴谌?biāo)本前無(wú)長(zhǎng)時(shí)間外用各種防治增生性瘢痕藥物史，不伴腫瘤及其他嚴(yán)重疾患；瘢痕組織生長(zhǎng)時(shí)間均在6～9個(gè)月之間。
1.2 主要試劑及物品準(zhǔn)備
羊抗CRT抗體：Michalak博士惠贈(zèng)。辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG(Zymed公司)。DAB及OPD(Sigma公司)。細(xì)胞培養(yǎng)基：DMEM添加10%小牛血清(上海華美生物技術(shù)有限公司)。96孔塑料培養(yǎng)板及100mm培養(yǎng)皿(丹麥Nunc公司)。
1.3 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)
手術(shù)切取增生性瘢痕及正常皮膚組織，去皮下脂肪，0.01%新潔爾滅浸洗10min，PBS洗3次，用組織剪將組織剪成細(xì)小碎塊并接種于培養(yǎng)皿內(nèi)，加少量10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃5%CO2靜止培養(yǎng)，3天后補(bǔ)充少量培養(yǎng)劑，隔2天換液，見(jiàn)有細(xì)胞從組織塊爬出生長(zhǎng)后每天換液，傳代。
1.4 CRT免疫細(xì)胞化學(xué)染色
體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞去培養(yǎng)基后，PBS輕洗，2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應(yīng)5min，PBS再洗；二抗血清37℃20min，抗CRT抗體37℃作用45min，HRP-兔抗羊IgG37℃反應(yīng)1h，DAB顯色；顯微鏡下觀察顯色信號(hào)。
1.5 CRT原位ELISA檢測(cè)［7］
選擇第5代培養(yǎng)細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，用0.25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，每孔100μl接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)。培養(yǎng)16h后，去培養(yǎng)劑，PBS清洗；2%多聚甲醛固定10min，0.3%雙氧水反應(yīng)5min，PBS洗；與0.1%Triton X-100 4℃作用3min后，進(jìn)一步分別與5%小牛血清(37℃、20min)、抗CRT抗體(37℃、1h)、5%小牛血清PBS稀釋的HRP-兔抗羊IgG(37℃、1h)反應(yīng)；PBS清洗后加入OPD底物液100μl，作用30min后用50μl1mol/L硫酸中止反應(yīng)。ELISA reader 上讀取492nm的P值。
2 結(jié)果
2.1 成纖維細(xì)胞初代培養(yǎng)結(jié)果
在體外相同培養(yǎng)條件下，細(xì)小的瘢痕及正常皮膚組織塊接種后2天見(jiàn)有部分貼壁，培養(yǎng)1周后有少量的成纖維細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，2周后細(xì)胞在組織塊周?chē)蕰灎罘植迹撕蠹?xì)胞開(kāi)始向外旺盛擴(kuò)散增殖。顯微鏡下觀察瘢痕及正常皮膚組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞形態(tài)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞均呈細(xì)小梭形狀，二者未見(jiàn)明顯差異。
2.2 成纖維細(xì)胞CRT表達(dá)的免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果
原代培養(yǎng)的瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞在未生長(zhǎng)融合前，細(xì)胞內(nèi)均有不同程度的CRT陽(yáng)性表達(dá)；一旦細(xì)胞生長(zhǎng)融合后，在融合區(qū)內(nèi)的成纖維細(xì)胞中均未見(jiàn)有明顯的CRT陽(yáng)性信號(hào)出現(xiàn)，但在融合區(qū)邊緣仍處于增殖、遷移擴(kuò)散的瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)，則仍有CRT的陽(yáng)性信號(hào)分布；就二種細(xì)胞內(nèi) CRT的表達(dá)信號(hào)強(qiáng)弱來(lái)看，瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的CRT陽(yáng)性信號(hào)相對(duì)較強(qiáng)，而正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)CRT陽(yáng)性信號(hào)相對(duì)較弱；另外，當(dāng)瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞以較高密度傳代培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)CRT表達(dá)在接種后16h較為明顯，而在培養(yǎng)24h細(xì)胞接近融合時(shí)信號(hào)較弱。
此外，CRT在瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)區(qū)域無(wú)明顯差異，往往在細(xì)胞漿、核膜及核內(nèi)均有表達(dá)。
2.3 成纖維細(xì)胞CRT表達(dá)的ELISA檢測(cè)結(jié)果
根據(jù)CRT免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果，我們對(duì)第5代瘢痕及正常皮膚成纖維細(xì)胞(接種后培養(yǎng)16h)進(jìn)行CRT表達(dá)的ELISA檢測(cè)，其中正常皮膚成纖維細(xì)胞組的CRT表達(dá)值為1.43±0.12(A)，瘢痕成纖維細(xì)胞組為1.97±0.15(A)，二組間差異有非常著性意義(P＜0.01)。
3 討論
增生性瘢痕是傷口上皮化愈合后組織內(nèi)成纖維細(xì)胞異?；罨蠢^續(xù)旺盛增殖并分泌大量膠原、纖維連接蛋白及蛋白多糖等細(xì)胞外間質(zhì)所造成的一種組織病理改變，有關(guān)瘢痕成纖維細(xì)胞為何異常活化一直是整形燒傷外科領(lǐng)域里重點(diǎn)探索的課題之一。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素-1和類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子-1等在增生性瘢痕組織內(nèi)的過(guò)度表達(dá)一直被認(rèn)為是引起成纖維細(xì)胞異?；罨豢珊鲆暤囊蛩兀絹?lái)越多實(shí)驗(yàn)研究表明瘢痕成纖維細(xì)胞自身生物學(xué)特性改變是觸發(fā)其功能異常的關(guān)鍵［8］。我們通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)CRT的表達(dá)檢測(cè)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CRT不但在瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)分布廣泛，而且其表達(dá)量明顯高于正常皮膚成纖維細(xì)胞內(nèi)水平。
CRT作為鈣離子主要結(jié)合蛋白，早期研究認(rèn)為CRT主要是通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子的儲(chǔ)存與釋放而影響細(xì)胞的一些生物學(xué)活性效應(yīng)，但近幾年的研究結(jié)果表明CRT除上述作用外，它在細(xì)胞遷移擴(kuò)散及細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)等方面均有直接的介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用。1997年，Zhu等人［9］通過(guò)對(duì)B16細(xì)胞CRT表達(dá)的深入研究發(fā)現(xiàn)實(shí)細(xì)胞內(nèi)的CRT分子常常與整合素粘附分子的α鏈胞內(nèi)區(qū)結(jié)合并成為雙向傳導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)的復(fù)合體；Coppolino等人［5］利用CRT缺乏而整合素表達(dá)正常的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞體外遷移粘附研究，證實(shí)在正常培養(yǎng)條件下干細(xì)胞的遷移擴(kuò)散能力很弱，而經(jīng)轉(zhuǎn)染CRT基因后，細(xì)胞的遷移粘附作用顯著增強(qiáng)。因此，Coppolino認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)CRT與整合素粘附分子直接參與細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)、粘附、遷移擴(kuò)散等生物學(xué)活性功能。Tsai等［10］曾利用體外結(jié)締組織收縮模型發(fā)現(xiàn)增生性瘢痕組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞在體外有著比正常皮膚成纖維細(xì)胞更強(qiáng)的遷移擴(kuò)散能力，并認(rèn)為其作用可能與細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白絲積聚有關(guān)。筆者在博士后研究工作階段卻發(fā)現(xiàn)在相同培養(yǎng)條件下增生性瘢痕組織來(lái)源的成纖維細(xì)胞除有著較強(qiáng)遷移擴(kuò)散能力外，還具有高表達(dá)β1、α1、α2、α3及α4整合素粘附分子的特性［11］，從而提示瘢痕成纖維細(xì)胞的強(qiáng)遷移擴(kuò)散能力與高表達(dá)整合素粘附分子有關(guān)；而從本實(shí)驗(yàn)對(duì)CRT在瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況來(lái)看，細(xì)胞內(nèi)其CRT表達(dá)并不屬持續(xù)性表達(dá)，CRT的高表達(dá)期一般是在細(xì)胞的遷移擴(kuò)散階段，而當(dāng)細(xì)胞融合后細(xì)胞內(nèi)CRT表達(dá)甚少。但就與同一時(shí)期培養(yǎng)的正常皮膚成纖維細(xì)胞相比，瘢痕成纖維細(xì)胞內(nèi)的CRT表達(dá)則顯得更為豐富。因此，結(jié)合我們以往的研究工作結(jié)果，我們認(rèn)為：瘢痕成纖維細(xì)胞異常的遷移擴(kuò)散能力是細(xì)胞內(nèi)豐富的CRT、整合素粘附分子表達(dá)及肌動(dòng)蛋白絲積聚共同作用的結(jié)果，其中積聚的肌動(dòng)蛋白絲是其異常遷移擴(kuò)散的重要?jiǎng)恿?lái)源，而有效表達(dá)的CRT及整合素粘附分子則是細(xì)胞與細(xì)胞外間質(zhì)之間遷移動(dòng)力的傳遞媒介；另外，CRT的豐富表達(dá)對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞鈣離子的儲(chǔ)存、釋放及其信號(hào)傳導(dǎo)等也有著重要的意義。
參考文獻(xiàn)
1 Krause KH， Michalak M.Calreticulin. Cell， 1997， 88:439-443.
2 Tector M， Zhang Q， Salter RD. Beta 2-microglobulin and calnexin can independently promote folding and disulfide bond formation in class I histocompatiblity proteins. Mol Immunol， 1997， 34:401-408.
3 Liu H，Bowes RC， van-de-Water B， et al. Endoplasmic reticulum chaperones GRP78 and calreticulin prevent oxidative stress， Ca2+ disturbances， and cell death in renal epithelial cells. J Biol Chem， 1997， 272:21751-21759.
4 Burns K， Opas M，Michalak M. Calreticulin inhibits glucocorticoid-but not cAMP-sensitive expression of tyrosine aminotransferase gene in cultrued McA-RH7777 hepatocytes. Mol Cell Biochem， 1997， 171:37-43.
5 Coppolino MG， Woodside MJ， Demaurex N， et al. Calreticulin is essential for integrin-mediated calcium signalling and cell adhesion. Nature， 1997， 386:843-847.
6 Eggleton P， Reid KB， Kishore U， et al. Clinical relevance of calreticulin in systemic lupus erythematosus. Lupus， 1997， 6:564-571.
7 Winisk A， Foster C. ICAM-1 expression in a spontaneously transformed human keratinocyte cell line:Characterization by a simple cell-ELISA assay. J Invest Dermal， 1992， 99:48-52.
8 Tredget EE， Nedelec B， Scott-PG， et al. Hypertrophic scars， keloids， and contractures. The cellular and molecular basis for therapy. Surg Clin North Am， 1997， 77:701-30.
9 Zhu Q， Zelinka P， White T， et al. Calreticulin-integrin bidirectional signaling complex. Biochem Biophys Res Commun， 1997， 232:354-358.
第5篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
關(guān)鍵詞：中小企業(yè)；信用擔(dān)保體系；現(xiàn)狀；問(wèn)題；措施
中圖分類(lèi)號(hào)：F830.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-291X（2012）34-0081-02
引言
中小企業(yè)融資難、擔(dān)保難已是世界性難題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者一直不斷為解決這一難題而辛苦探索，許多學(xué)者在解決中小企業(yè)融資難問(wèn)題上積極建言獻(xiàn)策，尤其在建立中小企業(yè)信用擔(dān)保體系方面，提出了不少建設(shè)性意見(jiàn)和建議。2008年，顧海峰在《結(jié)構(gòu)性金融創(chuàng)新與中國(guó)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系發(fā)展》中，重點(diǎn)指出了中國(guó)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系存在的結(jié)構(gòu)性缺陷，大膽提出了以商業(yè)性擔(dān)保機(jī)構(gòu)為主導(dǎo)的創(chuàng)新型擔(dān)保體系。蔡文佳等人在2006年《完善中國(guó)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的配套機(jī)制》一文中，提出要完善信用擔(dān)保體系，就必須推進(jìn)配套機(jī)制的改革，包括政府、銀行、信用擔(dān)保市場(chǎng)三方面的配套改革。雖然有關(guān)專(zhuān)家、學(xué)者已圍繞如何建立完善的信用擔(dān)保體系這一問(wèn)題紛紛做了研究，但隨著中國(guó)經(jīng)濟(jì)及國(guó)際背景的變化，繼續(xù)研究這一關(guān)乎國(guó)民經(jīng)濟(jì)持續(xù)健康發(fā)展的大問(wèn)題仍然具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
一、中小企業(yè)信用擔(dān)保體系在中國(guó)的發(fā)展?fàn)顩r
中國(guó)中小企業(yè)信用擔(dān)保的實(shí)施始于1992年，自實(shí)施以來(lái)就一直受到國(guó)家及各行各業(yè)的關(guān)注。1999年6月，國(guó)家經(jīng)貿(mào)委出臺(tái)《關(guān)于建立中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的指導(dǎo)意見(jiàn)》，從此以扶持中小企業(yè)發(fā)展為目的的信用擔(dān)保體系正式啟動(dòng)。2000年8月，國(guó)務(wù)院印發(fā)《關(guān)于鼓勵(lì)和扶持中小企業(yè)發(fā)展若干政策意見(jiàn)》，中小企業(yè)信用擔(dān)保體系開(kāi)始步入制度和體系的建設(shè)與完善階段。2003年，《中小企業(yè)促進(jìn)法》生效，中小企業(yè)信用擔(dān)保的內(nèi)容再次得到發(fā)展和完善?，F(xiàn)在，中國(guó)已初步形成了以政策性擔(dān)保為主、商業(yè)性和互擔(dān)保為輔的“一體兩翼”模式。但該體系仍處于初級(jí)階段，銀企、政企及擔(dān)保機(jī)構(gòu)之間尚存在許多不可調(diào)和的矛盾，因此，能否積極創(chuàng)新體制，健全中國(guó)的中小企業(yè)信用擔(dān)保體系，解決中小企業(yè)融資困境，促進(jìn)中小企業(yè)進(jìn)一步發(fā)展，將是未來(lái)一段時(shí)期內(nèi)我們?nèi)皂氈攸c(diǎn)研究的課題。
二、中國(guó)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的現(xiàn)存問(wèn)題
1.信用擔(dān)保結(jié)構(gòu)不合理。當(dāng)前國(guó)內(nèi)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系整體存在著嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)性金融缺陷，即由政府財(cái)政支持的政策性擔(dān)保為主，而商業(yè)擔(dān)保和中小企業(yè)之間的互助擔(dān)保比重不足，“重心偏上”現(xiàn)象嚴(yán)重。中國(guó)政府擔(dān)保額通常在60%以上，而美、日、德等國(guó)，政府擔(dān)?；静粫?huì)超過(guò)貸款總額的10%，這些國(guó)家的擔(dān)保體系不以政府為主導(dǎo)，而是以商業(yè)擔(dān)保為主。
企業(yè)貸款目的在于經(jīng)營(yíng)和盈利，屬于經(jīng)營(yíng)，而提供擔(dān)保是貸款行為的重要組成部分，因此擔(dān)保本質(zhì)上也是一種市場(chǎng)行為。所以，擔(dān)保產(chǎn)生的一系列問(wèn)題就應(yīng)由市場(chǎng)本身來(lái)解決，政府應(yīng)作為一個(gè)宏觀調(diào)控和社會(huì)管理者的身份存在，而不是作為一個(gè)十足的市場(chǎng)參與者來(lái)干預(yù)經(jīng)濟(jì)。事實(shí)上，政府在充分做好宏觀調(diào)控和社會(huì)管理職能后不可能再有足夠的財(cái)力在擔(dān)保體系中起主導(dǎo)作用。
2.擔(dān)保資金來(lái)源單一，缺乏有效的資金補(bǔ)償機(jī)制。目前中國(guó)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系仍然以政策性擔(dān)保為主，而政策性擔(dān)保機(jī)構(gòu)不以盈利為目的，只收取較低的擔(dān)保費(fèi)，資金來(lái)源主要是地方政府的財(cái)政資金和資產(chǎn)劃入，金額少、規(guī)模小，由此導(dǎo)致政策性擔(dān)保機(jī)構(gòu)資金來(lái)源單一，缺乏資金補(bǔ)償機(jī)制。大多數(shù)商業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)把高額擔(dān)保費(fèi)作為主要資金來(lái)源，但每年的保費(fèi)收入在扣除經(jīng)營(yíng)成本和稅負(fù)等費(fèi)用后，能夠用來(lái)補(bǔ)充擔(dān)保資金的部分也非常有限，因此商業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)的資本實(shí)力也普遍較弱。由于缺乏必要的資金補(bǔ)充機(jī)制，擔(dān)保機(jī)構(gòu)的承保能力較弱，一旦發(fā)生代償就會(huì)面臨虧損或破產(chǎn)的風(fēng)險(xiǎn)，所以擔(dān)保機(jī)構(gòu)只能謹(jǐn)慎經(jīng)營(yíng)，發(fā)展緩慢，從而阻礙了中小企業(yè)融資的需要。
3.擔(dān)保機(jī)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)防范能力較弱，缺乏風(fēng)險(xiǎn)分散機(jī)制。按國(guó)際慣例，擔(dān)保機(jī)構(gòu)對(duì)貸款的擔(dān)保比例一般應(yīng)控制在70%～80%之間。但在中國(guó)，信貸管理規(guī)定百分百全額擔(dān)保，風(fēng)險(xiǎn)全部轉(zhuǎn)嫁給了擔(dān)保機(jī)構(gòu)，造成擔(dān)保機(jī)構(gòu)責(zé)任與能力不對(duì)等，弱化了銀行對(duì)企業(yè)的考察和評(píng)估，加大了整體風(fēng)險(xiǎn)。而且國(guó)家級(jí)信用再擔(dān)保機(jī)構(gòu)尚未建立，擔(dān)保機(jī)構(gòu)也不能通過(guò)再擔(dān)保方式有效轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，以致其只能借助反擔(dān)保措施來(lái)降低自身風(fēng)險(xiǎn)。而中小企業(yè)融資難，原因就在于自身信用低，缺乏合格的抵押擔(dān)保品和第三方擔(dān)保人。擔(dān)保機(jī)構(gòu)的反擔(dān)保理論上雖然降低了自身風(fēng)險(xiǎn)，但實(shí)際上卻使中小企業(yè)向其申請(qǐng)擔(dān)保變得多余，不可能真正幫助中小企業(yè)擺脫融資困境。
4.信用體系不完善，社會(huì)化服務(wù)不健全。當(dāng)前中國(guó)正處于經(jīng)濟(jì)體制轉(zhuǎn)軌時(shí)期，市場(chǎng)化程度不高，信用體系建設(shè)落后，失信現(xiàn)象頻發(fā)，社會(huì)信用秩序十分混亂。全國(guó)尚未形成統(tǒng)一的中小企業(yè)信用征集、登記和評(píng)估系統(tǒng)，絕大多數(shù)中小企業(yè)沒(méi)有信用記錄，信用擔(dān)保機(jī)構(gòu)無(wú)法從自身以外的任何機(jī)構(gòu)獲得關(guān)于中小企業(yè)的信用信息，從而使擔(dān)保機(jī)構(gòu)為中小企業(yè)提供貸款的風(fēng)險(xiǎn)和成本大為提升。
當(dāng)前中國(guó)的金融體系也不夠完善，對(duì)中小企業(yè)的服務(wù)缺乏競(jìng)爭(zhēng)。在發(fā)達(dá)國(guó)家，向中小企業(yè)提供貸款的一般都是民間金融機(jī)構(gòu)，它們都主動(dòng)參與中小企業(yè)的融資擔(dān)保計(jì)劃，與擔(dān)保機(jī)構(gòu)主動(dòng)建立長(zhǎng)期、穩(wěn)定的合作關(guān)系，形成一種銀行對(duì)中小企業(yè)服務(wù)的良性競(jìng)爭(zhēng)態(tài)勢(shì)。而在中國(guó)，銀行實(shí)行高度集中的管理體制，大量金融資源被大型國(guó)有商業(yè)銀行掌控，缺乏專(zhuān)門(mén)為中小企業(yè)服務(wù)的銀行和金融機(jī)構(gòu)。國(guó)有商業(yè)銀行盡管把持著大量金融資源，但用于對(duì)中小企業(yè)的貸款僅占其信貸總額的很小一部分。在這種沒(méi)有競(jìng)爭(zhēng)的金融體系下，即使有擔(dān)保，中小企業(yè)也很難獲得貸款。
三、完善中國(guó)中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的措施
1.鼓勵(lì)商業(yè)擔(dān)保和互助擔(dān)保機(jī)構(gòu)的建立和發(fā)展，優(yōu)化中小企業(yè)信用擔(dān)保體系結(jié)構(gòu)。中小企業(yè)量多面廣，需要大量的間接融資，中小企業(yè)融資擔(dān)保市場(chǎng)會(huì)長(zhǎng)期處于供不應(yīng)求的局面，市場(chǎng)前景廣闊，正適合以盈利為目的的商業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)的發(fā)展壯大。而且，商業(yè)擔(dān)保機(jī)構(gòu)可以通過(guò)再擔(dān)保、反擔(dān)保、貸款保險(xiǎn)和多元化經(jīng)營(yíng)等途徑來(lái)分散風(fēng)險(xiǎn)，從而更加具有提供信用擔(dān)保的優(yōu)勢(shì)。為此，國(guó)家應(yīng)重點(diǎn)擴(kuò)大和發(fā)展商業(yè)性擔(dān)保機(jī)構(gòu)，提高其在擔(dān)保市場(chǎng)中的比重，逐步使其占據(jù)主導(dǎo)地位。
鼓勵(lì)中小企業(yè)互助擔(dān)保機(jī)構(gòu)的建立和發(fā)展，發(fā)揮民間資本的基礎(chǔ)作用。通過(guò)多個(gè)中小企業(yè)共同出資的方式組建互擔(dān)保機(jī)構(gòu)，用互助擔(dān)保機(jī)構(gòu)的資金和信譽(yù)為成員企業(yè)提供融資擔(dān)保。互助擔(dān)保機(jī)構(gòu)作為一個(gè)利益集團(tuán)，能夠在與協(xié)作銀行的談判中發(fā)揮優(yōu)勢(shì)作用，為中小企業(yè)爭(zhēng)取更多的利益。
政府擔(dān)保機(jī)構(gòu)應(yīng)本著市場(chǎng)化運(yùn)作的原則，盡量避免行政干預(yù)。政策性擔(dān)保機(jī)構(gòu)應(yīng)將資金委托給專(zhuān)業(yè)機(jī)構(gòu)擔(dān)保，從而有效防止政府直接干預(yù)，而且還可以充分利用專(zhuān)業(yè)人員，發(fā)揮政府擔(dān)保機(jī)構(gòu)的機(jī)能。而且，政府擔(dān)保應(yīng)對(duì)受擔(dān)保對(duì)象規(guī)定一定的標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)行動(dòng)態(tài)擔(dān)保。當(dāng)受擔(dān)保企業(yè)獲得貸款并發(fā)展到一定規(guī)模后，就不應(yīng)再是政府擔(dān)保的對(duì)象。要努力建立政府擔(dān)保同民間擔(dān)保相互分工、合作與補(bǔ)充的信用擔(dān)保體系。
2.實(shí)現(xiàn)擔(dān)保資金供給多元化，建立有效的資金補(bǔ)償機(jī)制。信用擔(dān)保資金須堅(jiān)持多元募集。其中，政府可將信用擔(dān)保資金納入財(cái)政預(yù)算中，每年劃撥一定資金作為擔(dān)?；?，并從科技發(fā)展基金、技改貸款貼息中劃出一定金額作為高科技行業(yè)的風(fēng)險(xiǎn)補(bǔ)償，也可以將中小企業(yè)稅收收入的一定比例專(zhuān)門(mén)用于擔(dān)保機(jī)構(gòu)的資金補(bǔ)償，還可以通過(guò)發(fā)行專(zhuān)項(xiàng)國(guó)債來(lái)補(bǔ)償中小企業(yè)擔(dān)保資金。各類(lèi)擔(dān)保機(jī)構(gòu)要建立風(fēng)險(xiǎn)準(zhǔn)備金制度，根據(jù)業(yè)務(wù)量，每年從保費(fèi)和利息收入中提取一定比例作為補(bǔ)充，形成風(fēng)險(xiǎn)補(bǔ)償基金，彌補(bǔ)擔(dān)保機(jī)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)損失。
國(guó)家財(cái)力有限，信用擔(dān)保不可能完全依賴(lài)財(cái)政資金，所以，政府應(yīng)放寬政策，積極鼓勵(lì)信用擔(dān)保資金多元化，如以員工持股方式募集、社會(huì)公眾募集、股份聯(lián)合、金融機(jī)構(gòu)捐助及鼓勵(lì)國(guó)內(nèi)外捐贈(zèng)資金投入等。另外，適當(dāng)引進(jìn)外資也是解決擔(dān)保資金約束問(wèn)題的一大途徑，如目前唯一被“泛美擔(dān)保協(xié)會(huì)”納入會(huì)員的中國(guó)經(jīng)濟(jì)技術(shù)投資擔(dān)保公司就已具備了引進(jìn)外資的條件。
3.完善風(fēng)險(xiǎn)分散機(jī)制，提高擔(dān)保機(jī)構(gòu)風(fēng)險(xiǎn)防范能力。鼓勵(lì)貸款銀行與擔(dān)保機(jī)構(gòu)建立風(fēng)險(xiǎn)共擔(dān)機(jī)制，使擔(dān)保機(jī)構(gòu)與銀行之間按約定比例共同分擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)被擔(dān)保方，擔(dān)保機(jī)構(gòu)可以運(yùn)用反擔(dān)保來(lái)分散風(fēng)險(xiǎn)，或運(yùn)用不同的擔(dān)保費(fèi)率和承保比例相結(jié)合的方式來(lái)鎖定自身風(fēng)險(xiǎn)。
允許和鼓勵(lì)保險(xiǎn)公司介入，按照合理負(fù)擔(dān)原則，為擔(dān)保機(jī)構(gòu)或擔(dān)?；鹛峁╋L(fēng)險(xiǎn)保險(xiǎn)。在此基礎(chǔ)上構(gòu)建與之相適應(yīng)的再擔(dān)保制度，設(shè)立專(zhuān)門(mén)的再擔(dān)保機(jī)構(gòu)，為貸款擔(dān)?；鸹驌?dān)保公司提供再擔(dān)保。政府擔(dān)?；鹨部梢杂兄攸c(diǎn)地為民間擔(dān)保機(jī)構(gòu)提供再擔(dān)保，在發(fā)揮政府資金引導(dǎo)作用的同時(shí)，從根本上提高其風(fēng)險(xiǎn)防范能力。
4.加快中小企業(yè)信用體系建設(shè)，營(yíng)造良好的社會(huì)信用環(huán)境。各級(jí)政府相關(guān)部門(mén)應(yīng)加大對(duì)中小企業(yè)的管理力度，加強(qiáng)立法，制定嚴(yán)格的失信懲戒制度，從法律和制度上約束失信行為，形成企業(yè)和全社會(huì)的信用約束機(jī)制，提高社會(huì)誠(chéng)信水平。同時(shí)，中小企業(yè)要強(qiáng)化自身信用意識(shí)，倡導(dǎo)企業(yè)信用文化，規(guī)范財(cái)務(wù)制度，提高財(cái)務(wù)信息透明度，積極建立與金融機(jī)構(gòu)的信息互換機(jī)制，以便銀行進(jìn)行科學(xué)、準(zhǔn)確的資信調(diào)查，提高企業(yè)的資信等級(jí)。此外，還需建立一個(gè)強(qiáng)大完整的中小企業(yè)信用評(píng)級(jí)系統(tǒng)，組織信用評(píng)級(jí)機(jī)構(gòu)開(kāi)展對(duì)中小企業(yè)的信用評(píng)級(jí)工作，實(shí)現(xiàn)信用信息共享。
總之，中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的建立和完善是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜的系統(tǒng)工程，政府、金融機(jī)構(gòu)、擔(dān)保機(jī)構(gòu)和企業(yè)都要努力參與其中，緩解中小企業(yè)的融資困境，共同推動(dòng)中小企業(yè)的發(fā)展壯大，從而增強(qiáng)中小企業(yè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。
參考文獻(xiàn)：
[1] 金峰.中小企業(yè)信用擔(dān)保的對(duì)策建議[J].當(dāng)代經(jīng)濟(jì)，2004，（4）.
[2] 賀津，曹黔然.建立多元化中小企業(yè)信用擔(dān)保體系的新思考[J].金融論壇，2007，（6）.
[3] 陳小榮，張晶.國(guó)外中小企業(yè)融資的經(jīng)驗(yàn)做法及對(duì)中國(guó)的啟示[J].商場(chǎng)現(xiàn)代化，2008，（6）.
第6篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
關(guān)鍵詞：氧化低密度脂蛋白；THP-1細(xì)胞；細(xì)胞凋亡；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
中圖分類(lèi)號(hào)：R329.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-1349（2011）08-0973-03
近年來(lái),細(xì)胞凋亡在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和進(jìn)展中的作用日漸成為研究熱點(diǎn),斑塊破裂伴血栓形成是造成動(dòng)脈粥樣硬化臨床急性癥狀的主要原因,而大量的細(xì)胞凋亡直接造成斑塊不穩(wěn)定［1］。巨噬細(xì)胞通過(guò)對(duì)斑塊內(nèi)脂質(zhì)含量、炎癥反應(yīng)、纖維成分的降解及新血管形成等方面來(lái)影響動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)展,在動(dòng)脈粥樣硬化形成的所有階段都起著極其重要的作用［2］。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是動(dòng)脈粥樣硬化重要的危險(xiǎn)因素,ox-LDL被巨噬細(xì)胞大量吞噬后會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)大量膽固醇的聚集并進(jìn)一步形成泡沫細(xì)胞，同時(shí)會(huì)導(dǎo)致血循環(huán)中的單核細(xì)胞向內(nèi)皮表面黏附并不斷向內(nèi)皮下趨化,并在內(nèi)皮下分化成常駐的巨噬細(xì)胞［3］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損傷引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS），通過(guò)激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)（UPR）以保護(hù)由ERS所引起的細(xì)胞損傷，長(zhǎng)期過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激便會(huì)誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡［4］。不同于經(jīng)典的凋亡途徑，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)性凋亡途徑是一種最近提出的新的凋亡途徑，研究其發(fā)生機(jī)制可為動(dòng)脈粥樣硬化等相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供新的方向。本研究主要探討ox-LDL對(duì)人單核巨噬細(xì)胞（THP-1）凋亡的影響及其引起凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激機(jī)制。
1 材料與方法
1.1 實(shí)驗(yàn)材料
1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 CO2孵箱（HERA cell 150）,倒置顯微鏡（Nikon TS100，日本）,超凈工作臺(tái)（LONGHONG，中國(guó)）,恒溫水浴箱（HS-4，成都儀器廠）,低溫臺(tái)式離心機(jī)（Labofuge 400R，Heraeus），F(xiàn)ACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 人 THP-1單核細(xì)胞購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)。ox-LDL由北京醫(yī)科大附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室饋贈(zèng)。RPMI1640培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國(guó)）,10%胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）,胰蛋白酶（solarbio,Spain），PMA（Sigma,美國(guó)），鼠抗人GRP78、Caspase-12、CHOP一抗及羊抗鼠IgG二抗均購(gòu)自Santa Cruz美國(guó)公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與誘導(dǎo) 將人THP-1單核細(xì)胞懸浮于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，在5% CO2、37℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞呈球形，懸浮狀態(tài)。視細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代、換液，選擇生長(zhǎng)良好的第3代～第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前在培養(yǎng)液中加入終濃度為100 mmol/L的PMA孵育48 h，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞。在光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為貼壁狀態(tài)，并伸出偽足，呈現(xiàn)巨噬細(xì)胞形態(tài)。
1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 對(duì)照組:細(xì)胞置1640培養(yǎng)基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。ox-LDL組:在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中分別加入ox-LDL（25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL）在1640培養(yǎng)基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。在細(xì)胞的培養(yǎng)瓶中加入ox-LDL 75 μg/mL在1640培養(yǎng)基中于5% CO2、37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。
1.2.3 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色法進(jìn)行檢測(cè)，分組分孔收集細(xì)胞（1×106個(gè)），1 000 r/min離心5 min，棄上清液，每管用200 μL PBS重懸成單細(xì)胞懸液。加入10L Annexin V-FITC和5L PI，加入300L Binding Buffer輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，以凋亡的巨噬細(xì)胞占巨噬細(xì)胞總數(shù)的百分比為凋亡率。
1.2.4 Western blot測(cè)GRP78、Caspase-12、CHOP的表達(dá) 分組分孔收集細(xì)胞（1×106個(gè)）,進(jìn)行免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達(dá)。將每管細(xì)胞洗滌,離心,用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,在其中加入等體積的樣品緩沖液混勻，沸水煮沸5 min，使蛋白質(zhì)變性，將蛋白質(zhì)分裝并凍存于-70 ℃冰箱中保存。取樣品蛋白質(zhì)100 μg,用10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜、封閉，依次加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗孵育2 h后，ECL發(fā)光液孵育5 min后，置于圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像掃描及強(qiáng)度分析。
1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，多重比較采用LSD法，P
2 結(jié) 果
2.1 ox-LDL對(duì)THP-1細(xì)胞凋亡的影響 各組細(xì)胞經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)良好， ox-LDL處理的細(xì)胞則出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
表1 不同濃度ox-LDL作用THP-1細(xì)胞
48 h后凋亡情況（x±s）%
表2 75 μg/mL ox-LDL作用于THP-1細(xì)胞
凋亡情況（x±s）%
2.2 各組細(xì)胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達(dá) 常規(guī)培養(yǎng)的對(duì)照組無(wú)GRP78、CHOP、Caspase-12蛋白的表達(dá)，用50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL濃度的ox-LDL培養(yǎng)細(xì)胞48 h后 GRP78、CHOP、Caspase-12表達(dá)均增加。詳見(jiàn)圖 1。
注：1為對(duì)照組，2為50μg/mL組，3為100μg/mL組，4為200 μg/mL組。
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圖1 各組細(xì)胞GRP78、Caspase-12、CHOP蛋白的表達(dá)
3 討 論
細(xì)胞凋亡是動(dòng)脈粥樣硬化病變的主要特征之一,其中巨噬細(xì)胞凋亡貫穿動(dòng)脈粥樣硬化的整個(gè)過(guò)程。巨噬細(xì)胞泡沫化及其最終凋亡的過(guò)程中泡沫細(xì)胞聚集壞死形成脂核并使其不斷增大,導(dǎo)致臨件發(fā)生［5］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊和鈣離子存儲(chǔ)的主要場(chǎng)所，對(duì)多種生理功能的完成具有重要意義。然而，細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)氧化環(huán)境被破壞，鈣代謝紊亂，突變的蛋白質(zhì)產(chǎn)生或蛋白質(zhì)的二硫鍵不能形成，大量異常的蛋白質(zhì)聚集在細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)失衡，這種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂狀態(tài)被稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［6］。 GRP78被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑，也被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志，但是過(guò)強(qiáng)或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡［7］。Caspase-12 激活是觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。Caspase-12 以酶原形式存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜胞漿側(cè),在ERS 時(shí)被特異激活而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。CHOP也是觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡途徑的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。CHOP 又稱(chēng)生長(zhǎng)停滯及DNA 損傷基因（Growth Arrestand DNA Damage Induciblegene 153,GADD 153）,存在于細(xì)胞漿內(nèi),在ERS 時(shí)被活化轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核,通過(guò)下調(diào)Bcl-2 表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。 本實(shí)驗(yàn)以不同濃度的ox-LDL與THP-1細(xì)胞共同培養(yǎng)不同時(shí)間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)ox-LDL以時(shí)間和濃度依賴(lài)的方式誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞的凋亡。ox-LDL濃度為100 μg/mL作用48 h最明顯。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和濃度增加THP-1細(xì)胞凋亡呈遞增后遞減變化。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激啟動(dòng)的凋亡途徑是近年才發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡途徑，用ox-LDL培養(yǎng)人THP-1細(xì)胞并檢測(cè)Caspase12、CHOP、GRP78蛋白的變化來(lái)探討ox-LDL是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn)100 μg/mL 的ox-LDL作用于細(xì)胞48 h后,GRP78、Caspase-12、CHOP的表達(dá)都明顯增加,提示ox-LDL可以通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)細(xì)胞凋亡。 不同于線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，ERS引起的細(xì)胞凋亡有一套自身的信號(hào)傳遞通路，稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性死亡（ER-associated death，ERAD）途徑，而且參與ERS 的分子伴侶和感受蛋白是ERS 特異誘導(dǎo)的，因此能夠作為治療相關(guān)疾病的有效靶點(diǎn)。
參考文獻(xiàn):
［1］ Rossi ML,Marziliano N,Merlini PA,et al.Different quantitative apoptotic traits in coronary atherosclerotic plaques from patients with stable angina pectorisandacutecoronarysyndromes［J］.Circulation,2004,110（13）:767-773.
［2］ Schrijvers DM,De Meyer GR,Herman AG,et al.Phagocytosis in atherosclerosis:Molecular mechanisms and implications for plaque progression and stability［J］.Cardiovasc Res,2007,73（3）:470-480.
［3］ Chen HJ,Li DY.Transforming growth factorbeta1 modulates oxidatively modified LDL-induced expression of adhesion molecules:Role of LOX-1［J］.Circulation Research,2001,89:1155-1160.
［4］ Pahl HL.Signal transduction from the endoplasmic reticulum to the cell nucleus［J］.Physiol Rev,1999,79（3）:683-701.
［5］ Tabas I.Signal transduction pathways in free cholesterol-loaded macrophages:Cell biological insight into the progression of atherosclerosis［J］.International Congress Series,2004,1262:392-395.
［6］ Kaufman RJ.Orchestrating the unfolded protein response in health and disease［J］.J Clin Invest,2002,110（10）:1389-1398.
［7］ Luo SZ,Mao CH,Brenda Lee,et al.GRP78 /BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development［J］.Molecular Cellular Biol,2006,26（15）:5688-5697.
［8］ Xie Q,Khaoustov VI,Chung CC,et al.Effect of tauroursodeoxycholic acid on ER stress-induced Caspase-12 activation［J］.Hepatology,2002,36（3）:592-601.
作者簡(jiǎn)介：張峰娟（1981―），女，醫(yī)師，現(xiàn)為山西醫(yī)科大學(xué)2008級(jí)研究生（郵編：030001）；邊云飛，工作于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；劉金帥，工作于潞安集團(tuán)總醫(yī)院。
第7篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
【關(guān)鍵詞】 天花粉蛋白；，，HeLa細(xì)胞；，，細(xì)胞凋亡
摘要：目的研究天花粉蛋白(TCS)對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用， 探討TCS抗腫瘤的作用機(jī)制。方法采用MTT法檢測(cè)TCS對(duì)Hela細(xì)胞的抑制作用，形態(tài)學(xué)觀察、DNA電泳及流式細(xì)胞儀檢測(cè)TCS對(duì)HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果TCS對(duì)HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞圓縮，胞漿凝聚等凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，DNA凝膠電泳呈梯級(jí)格局，流式檢測(cè)出現(xiàn)凋亡峰，凋亡比例具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性。結(jié)論 天花粉蛋白通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡而抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖。
關(guān)鍵詞：天花粉蛋白； HeLa細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡
Experimental Study of Trichosanthin's Effect on Hela Cells Proliferation
Abstract：ObjectiveTo study the inhibitory effect of trichosanthin(Tcs) on Hela cells and its anti-tumor mechanism.MethodsThe antiproliferative effect of TCS on Hela cells was measured with MTT assay. Light microscopy was used to observe the morphology changes ， DNA agarose electrophoresis and FCM analysis were carried out to examine the induced apoptosis.ResultsThe proliferation of HeLa cells was significantly inhibited by TCS， Hela cells showed a serial of characteristic changes of apoptosis such as cell volume shrinkage ， chromatin condensation; the occurrence of DNA ladder and apoptosis rate of Hela cells was dose and time dependent. Conclusion Trichosanthin can inhibit the proliferation of Hela cells by its induction of apoptosis.
Key words： Trichosanthin; Hela cell; Proliferation
宮頸癌是導(dǎo)致婦女死亡的第二大原因，嚴(yán)重威脅女性身體健康。天花粉蛋白（Trichosanthin，TCS）是從葫蘆科植物栝樓（Trichosanthin kirilouii Maxim）的塊根中提取出來(lái)的一種單鏈核糖體失活蛋白(ribosome - inactivating protein ， RIP)，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，主要包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒等作用［1］ 。目前，TCS的抗腫瘤研究主要集中在絨毛膜上皮癌、胃腸道腫瘤和白血病等方面［2～3］。本實(shí)驗(yàn)研究TCS對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，并從誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的角度探討其抗癌作用，為藥物的進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1 材料與方法
1.1 試劑 MEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS）購(gòu)自美國(guó)GIBCOBRL公司，碘化丙啶（Propidium Iodide ，PI）及RNase A (RNA酶)為Simga公司產(chǎn)品，噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Amresco公司。二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自Fluka公司，TCS購(gòu)自上海金山制藥廠（純品，規(guī)格為1.2 mg/ml）。
1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞為本室傳代保存，培養(yǎng)于5%CO2，37℃濕化孵箱中。培養(yǎng)基MEM含10%FBS，0.1 U/L青霉素，0.1 U/L鏈霉素，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞待用。
1.3 細(xì)胞生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)采用噻唑藍(lán)(MTT)還原法進(jìn)行檢測(cè):將Hela細(xì)胞接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)(每孔的細(xì)胞數(shù)為2×104個(gè))，細(xì)胞貼壁后對(duì)照組換新鮮培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組換用含有不同濃度TCS的培養(yǎng)基，置 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng) 24 ，48，72 h ，去上清，加入 MTT 溶液200 μl/孔，置 CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 4 h，去上清，每孔加入200 μl DMSO ，輕度振蕩后，測(cè)定 570 nm 處光吸收值。取8孔吸收值平均數(shù)，按公式細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組平均吸光度值/對(duì)照組平均吸光度值)×100%計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。
1.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè)
1.4.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將處于指數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞以不同濃度的TCS處理后，倒置顯微鏡下觀察Hela細(xì)胞的形態(tài)改變。
1.4.2 DNA瓊脂糖凝膠電泳 胰蛋白酶消化收獲實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照細(xì)胞， 1 000 r/min離心5 min，PBS清洗細(xì)胞兩遍， NP40溶液作用細(xì)胞沉淀，加入SDS(終濃度1%)及RNase(終濃度2 μg/μl)，56℃處理2 h，蛋白酶K(終濃度2 μg/μl)37℃作用3～5 h， 加入1/10體積的3M醋酸鈉及2倍體積的無(wú)水乙醇，輕輕振搖后置于-70℃冰箱中過(guò)夜， 14 000 r/min離心15 min，棄上清，用冰冷的 70％乙醇漂洗，1.2% 瓊脂糖凝膠30 V電泳3～5 h，紫外觀察拍照。
1.4.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分別離心收集對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，以含0.2%FBS的PBS清洗后加入75%冰冷的乙醇固定， 在10 000 r/min條件下離心5 min，去乙醇，PBS洗滌兩次，棄上清；用0.5 ml PBS重懸，加入等體積的細(xì)胞裂解緩沖液室溫作用5
min，加Rnase A (終濃度30 μg/ml)置37℃水浴中消化30 min，離心后再加人1m1 PI染色(終濃度50 μg/ml)避光染色30 min，以300目尼龍網(wǎng)濾過(guò)，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)， Multicycles 軟件分析結(jié)果。
1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用 SPSS 10.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包作ANOV方差分析。
2 結(jié)果
2.1 MTT法測(cè)定結(jié)果20，40和80 μg/ml的天花粉蛋白分別作用于Hela細(xì)胞后，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率逐漸升高，且抑制率隨藥物濃度增加而上升， 呈一定的劑量、時(shí)效依賴(lài)性。結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 TCS對(duì)Hela細(xì)胞作用的時(shí)間-劑量曲線（略）
2.2 Hela細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變 鏡下可見(jiàn)(×200)對(duì)照組Hela細(xì)胞始終為多角形，梭形，貼壁牢固， TCS處理的Hela細(xì)胞逐漸變圓， 細(xì)胞體積縮小，胞漿凝縮， 折光率增強(qiáng)， 呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變。結(jié)果見(jiàn)圖2。
圖2 Hela 細(xì)胞形態(tài)改變（略）
2.3 DNA凝膠電泳圖譜 凝膠電泳分析經(jīng)不同濃度的TCS（20，40和80 μg/ml）處理48 h的Hela細(xì)胞DNA斷裂成相差約200 bp的片段，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的梯級(jí)（ladder）格局，而對(duì)照組細(xì)胞DNA無(wú)斷裂現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)圖3。
圖3 凋亡細(xì)胞DNA瓊脂糖凝膠電泳（略）
2.4 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 凋亡細(xì)胞在流式細(xì)胞儀直方圖上可出現(xiàn)特征性的亞二倍體峰（sub―G1 peak）。由表1可見(jiàn)， 隨著天花粉蛋白藥物濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞的比例增加，表明TCS誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡具有時(shí)間和劑量依賴(lài)性。
表1 凋亡細(xì)胞在各組標(biāo)本中所占的百分比時(shí)間（略）
3 討論
細(xì)胞凋亡是細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中發(fā)生的一種復(fù)雜的生理過(guò)程。Dunne等［4］發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生與細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)紊亂密切相關(guān)。有資料表明，許多抗癌藥物都是通過(guò)最終觸發(fā)腫瘤細(xì)胞凋亡而達(dá)到治療的目的，有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的新的手段之一［5］。天花粉蛋白(TCS)是一種有效并具有專(zhuān)一性的抗腫瘤藥物，與一般化療藥物造成的腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞兩敗俱傷的作用不同，它對(duì)人的外周血淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞和羊膜細(xì)胞等正常體細(xì)胞影響極?。?］，具有顯著優(yōu)勢(shì)。天花粉蛋白是Ⅰ型單鏈核糖體失活蛋白(ribosome-inactivating protein ， RIP)，能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)直接使核糖體失活。TCS能夠使絨毛癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，其誘導(dǎo)凋亡的作用與胞內(nèi)的Ca2+濃度升高和活性氧基團(tuán)(reactiveoxygenspecies，ROS)的產(chǎn)生有關(guān)［7～8］。本實(shí)驗(yàn)將天花粉蛋白處理HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)受到明顯抑制，出現(xiàn)凋亡的特征性改變：染色體凝聚、核碎裂等形態(tài)改變，凝膠電泳呈現(xiàn)典型的梯級(jí)（ladder）格局，流式結(jié)果可見(jiàn)特征性的亞二倍體峰，且凋亡細(xì)胞的比例隨藥物濃度的增高及作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。這些結(jié)果表明TCS對(duì)Hela細(xì)胞具有良好的抑制作用和明顯的誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)，并具有濃度和時(shí)間依賴(lài)性，初步顯示了良好的藥物開(kāi)發(fā)前景。對(duì)其抗癌機(jī)理進(jìn)行深入研究，有望應(yīng)用于宮頸癌等腫瘤的臨床治療。
參考文獻(xiàn)：
［1］ Shaw PC ，lee KM ，wong KB.recent advances in trichosanthin， a ribosome-inactivating protein with multiple pharmacological properties ［J］.Toxicon.2005， 45(6)：683.
［2］ 汪 猷，金善煒.天花粉蛋白，第2版［M］.北京：科學(xué)出版社，2000.
［3］ 孫 ，涂水平，吳裕圻，等.天花粉蛋白誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞MKN245凋亡中P53、Bcl2、 cmyc蛋白表達(dá)變化［J］.上海醫(yī)學(xué)，2001，21（4）：291.
［4］ Dunne AL，Price ME，Mothersill C，et al.Relationship between clonogenic radiosensitivity ，radiation-induced apoptosis and DNA damage/repair in human colon cancer cells［J］.Br J Cancer.2003，89(12)：2277.
［5］ Waxman DJ，Schwartz PS.Harnessing apoptosis for improved anticancer gene therapy［J］.Cancer Res，2003，63(24)：8563.
［6］ 戴榮禧，徐國(guó)江，劉蓮英，等. 天花粉蛋白對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞專(zhuān)一損傷機(jī)制的研究［J］.實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，1993，26（24）：411.
［7］ Zhang CY，Gong YX，Ma H，et al.Reactive oxygen species involved in trichosanthin induced apoptosis of human choriocarcinoma cells［J］.Biochem，2001，355：653.
第8篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
關(guān)鍵詞 樹(shù)突狀細(xì)胞 流式細(xì)胞術(shù) 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)
AbstractObjective:To induce and culture purity dendritic cells（DCs） of different maturation phase from human peripheral blood monocytes in vitro.Methods:The peripheral blood mononuclear cells were isolated from human peripheral blood with density gradient centrifugation.The first step was to work on a 7-day culture of monocytes in medium supplement with 100ng/ml rhGM-CSF and 5ng/ml rhIL-4,and the cells were actually immature.In the second step,the cells were cultured in the medium supplement with GM-CSF and TNF-α,and cultured until the 14th day.Mature DCs were obtained.Cells harvested were identified for their morphology by microscope,properties of DCs detected by FCM,function with MLR method.Results:Immature dendritic cells expressed CD1a molecules and costimulating molecules in middle level,HLA-DR in high level.In maturation phase DCs expressed costimulating molecules,HLA-DR molecules,CD83,and CD11c highly.These DCs could stimulate proliferation of allogenic T lymphocytes.Conclusion:The method to obtain DCs of different maturation phases from human peripheral blood monocytes is successfully set up.A number of DCs with high purity are obtained.
KeyWordsdendritic cells;flow cytometry;mixed lymphocyte reaction（MLR）
樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）是溝通天然免疫和獲得性免疫的橋梁，對(duì)于免疫反應(yīng)的啟動(dòng)、進(jìn)展以及免疫耐受的誘導(dǎo)至關(guān)重要［1，2］。很多學(xué)者應(yīng)用體外大量擴(kuò)增DCs，然后用腫瘤抗原沖擊后回輸患者治療腫瘤，取得一定效果［3］。然而外周血中的含量也僅占單個(gè)核細(xì)胞總量的0.5%～1.0%，難以分離和純化。本研究采用細(xì)胞因子（GM-CSF、IL-4、TNF-α）聯(lián)合培養(yǎng)，在促成熟期不再加入IL-4的方法，獲得成熟DCs。
資料與方法
一般資料：外周血：健康男性成人獻(xiàn)血者，晨起空腹抽取肘靜脈血。
主要試劑：重組人白細(xì)胞介素4（rh IL-4，Peprotech公司）；重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF，廈門(mén)特寶生物公司）；CD1α-FITC、CD80-FITC等單克隆抗體（BD公司）；DMSO（Sigma公司）。
方法：①DC的誘導(dǎo)培養(yǎng)：在離心管內(nèi)加入體積比為1:1.5的淋巴細(xì)胞分離液和肝素化的新鮮稀釋血液，離心25分鐘，吸取界面層單個(gè)核細(xì)胞，用生理鹽水洗滌2次，棄上清獲得人外周血單個(gè)核細(xì)胞。將獲得的單個(gè)核細(xì)胞用含10%自體血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基將所得細(xì)胞重懸，混勻，調(diào)整細(xì)胞濃度為（2～3）×106個(gè)/ml，以1ml/孔加入24孔培養(yǎng)板中。將培養(yǎng)板置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，孵育6小時(shí)后，吸棄培養(yǎng)上清，祛除非貼壁細(xì)胞，即可獲得貼壁的DC前體細(xì)胞。將獲得的貼壁細(xì)胞用每孔加入含rhGM-CSF（100ng/ml）和rhIL-4（5ng/ml）的RPMI1640完全培養(yǎng)基1ml，隔天半量換液，A組培養(yǎng)至7天收集細(xì)胞，B組培養(yǎng)至7天換培養(yǎng)液即含rhGM-CSF（100ng/ml）和TNF-α（10ng/ml）的RPMI1640完全培養(yǎng)基1ml，隔天半量換液，培養(yǎng)至14天收集成熟DC細(xì)胞。培養(yǎng)期間用倒置相差顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞形態(tài)變化和細(xì)胞生長(zhǎng)趨勢(shì)。②DCs表面相關(guān)表型的檢測(cè)：將不同時(shí)期的DCs用PBS調(diào)至106/ml，加入離心管，每管20μl/106個(gè)細(xì)胞，加FITC標(biāo)記的CD80、CD86、CD1a和PE標(biāo)記的CD83、HLA-DR及APC標(biāo)記的CD11c單抗，4℃冰箱避光孵育30～60分鐘，PBS洗滌，用600μl PBS重懸細(xì)胞待測(cè)。③混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：效應(yīng)細(xì)胞制備，取異體的健康人外周靜脈血，經(jīng)上述方法獲得PBMC，貼壁法獲得非貼壁細(xì)胞，即為同種異體淋巴細(xì)胞。刺激細(xì)胞制備，培養(yǎng)7天和14天的DCs組，按刺激細(xì)胞:應(yīng)答細(xì)胞（DCs:同種異體淋巴細(xì)胞）1:10、1:100及1:1000的比例加入96孔培養(yǎng)板，各100μl，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)復(fù)孔，混合培養(yǎng)4天后，1000r/分，離心5分鐘，棄去上清120μl，每孔加入5g/L的MTT 20μl，37℃、5% CO2條件下孵育4小時(shí)，1000r/分，離心5分鐘，棄去全部上清，每孔加入DMSO 100μl，微型振蕩10分鐘，酶標(biāo)儀490nm處測(cè)各孔吸光度（A）值，結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔的均值表示。
統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行方差分析，以X±S表示。
結(jié) 果
DCs形態(tài)學(xué)觀察：PBMC經(jīng)2小時(shí)貼壁后，有部分細(xì)胞懸浮，多為B淋巴細(xì)胞和外周血DCs；當(dāng)加入GM-CSF、IL-4過(guò)夜培養(yǎng)后，貼壁細(xì)胞數(shù)量較少，體積?。徽T導(dǎo)2天，貼壁細(xì)胞伸展，呈高度多形性；培養(yǎng)5天，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，粗細(xì)不等的毛刺多而密，呈現(xiàn)典型的DCs形態(tài)；第7天時(shí)正常組DC表面突起更加明顯；當(dāng)加入TNF-α后，成簇現(xiàn)象明顯增多，并且大量突起交織；但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，梭形細(xì)胞減少，個(gè)別細(xì)胞開(kāi)始增大變圓，在培養(yǎng)14天，幾乎所有DCs均逐漸增大變圓，出現(xiàn)懸浮趨勢(shì)。對(duì)于在7天之后未加TNF-α的A組細(xì)胞未出現(xiàn)B組細(xì)胞的成熟現(xiàn)象。結(jié)果見(jiàn)圖1、2。
圖1 第7天
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志結(jié)果：按DCs常規(guī)培養(yǎng)7天后，再次檢測(cè)DCs的特異標(biāo)記，達(dá)到成熟水平；誘導(dǎo)14天后，DCs的成熟標(biāo)記的表達(dá)量均高于7天組的表達(dá)量（P＜0.05），而DCs的CD1a標(biāo)記的表達(dá)量?jī)山M比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。
混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)：7天組的DCs由于沒(méi)有完全成熟，促進(jìn)T細(xì)胞增殖的作用不明顯，但經(jīng)過(guò)促成熟因子TNF-α刺激后的DCs，達(dá)到完全成熟后，DCs明顯促進(jìn)同種淋巴細(xì)胞增殖（P＜0.05），并且隨著DCs濃度的下降增殖效果減弱。見(jiàn)表2。
討 論
本實(shí)驗(yàn)利用其外周血取材簡(jiǎn)單方便的優(yōu)點(diǎn)，從中獲得PBMC，在反復(fù)實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞屬于貼壁細(xì)胞，然而在隔天換液的時(shí)候仍有較多的懸浮細(xì)胞，這些懸浮的細(xì)胞大多是B淋巴細(xì)胞，因此經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間的貼壁培養(yǎng)加上在換液時(shí)將懸浮細(xì)胞祛除，便得到較多的純度較高的單個(gè)核細(xì)胞分化而來(lái)的DCs。經(jīng)過(guò)GM-CSF、IL-4聯(lián)合誘導(dǎo)后，可以從每100ml外周血中獲得9×106個(gè)未成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞。由于IL-4在誘導(dǎo)過(guò)程中主要抑制培養(yǎng)體系中中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)，并維持DCs的未成熟狀態(tài)。因此，在培養(yǎng)7天后本實(shí)驗(yàn)就用GM-CSF和TNF-α聯(lián)合在誘導(dǎo)7天至其成熟，這樣既節(jié)省了培養(yǎng)成本，又能獲得成熟的DCs。
本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人外周血誘導(dǎo)獲得的DCs在形態(tài)學(xué)上完全符合不成熟、成熟的典型形態(tài)即樹(shù)突樣的突起以及后期變大變圓；表面分子的表達(dá)情況，在未成熟期時(shí)，DCs中度表達(dá)CD1a、CD80、CD86、CD83、CD11c、及HLA-DR；經(jīng)過(guò)TNF-α誘導(dǎo)后，DCs成熟后，高表達(dá)CD80、CD86、CD83、HLA-DR及CD11c，對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞表面表達(dá)的CD1a分子，在培養(yǎng)體系中加入TNF-α前后，期表達(dá)量變化不明顯，可與其他表面分子共同作為區(qū)分未成熟DCs與成熟DCs表面標(biāo)志物；通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)一步驗(yàn)證了未成熟DCs只有較弱的激活T細(xì)胞的能力，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)后變?yōu)槌墒霥Cs就具有了強(qiáng)大的激活初始型T細(xì)胞的能力。
DCs的來(lái)源成為很多研究的瓶頸，本實(shí)驗(yàn)從簡(jiǎn)單方便的外周血中用細(xì)胞因子誘導(dǎo)出大量功能性的成熟DCs，為研究DCs的作用以及臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
圖2 第14天
參考文獻(xiàn)
1 Casas R,Skarsvik S,Lindstr？m A,et al.Impaired maturation of monocyte-derived dendritic cells from birch allergic individuals in association with birch-specific immune responses［J］.Scand J Immunol,2007,66（5）:591-598.
第9篇：?jiǎn)渭?xì)胞研究范文
【關(guān)鍵詞】 缺血再灌注；凋亡；丹參；中藥；綜述
在肝、腎、腦等器官缺血再灌注損傷(Ischimia reperfusion injury,IRI)造成的細(xì)胞死亡形式中，凋亡也是一種常見(jiàn)而重要的形式[1-4]。組織細(xì)胞一旦壞死，目前人們尚無(wú)辦法干預(yù)；但細(xì)胞凋亡是受一系列程序控制的過(guò)程，人們有可能通過(guò)干預(yù)死亡程序加以挽救。丹參經(jīng)現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)證實(shí)，對(duì)IRI時(shí)細(xì)胞過(guò)度凋亡有抑制作用，本文就此方面的內(nèi)容予以綜述。
1 丹參對(duì)IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的抑制作用
Wu.W等[5]利用原位細(xì)胞凋亡標(biāo)記(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated uridine nucleotide end labeling,TUNEL)實(shí)驗(yàn)觀察到：左大腦中動(dòng)脈結(jié)扎后24 h大鼠大腦皮層、尾狀核、豆?fàn)詈巳毖獏^(qū)出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞，24~48 h達(dá)到高峰；預(yù)先給予丹參則在相應(yīng)部位只見(jiàn)到少量凋亡細(xì)胞；且與對(duì)照組比較，24 h時(shí)間段組織損傷明顯減輕。提示丹參可能通過(guò)減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡對(duì)腦IRI發(fā)揮保護(hù)作用。丹參是否對(duì)其他器官也有類(lèi)似作用目前尚未明了。
2 丹參抑制IRI時(shí)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制
2．1 減少蛋白酶表達(dá)
細(xì)胞發(fā)生凋亡的中心環(huán)節(jié)是激活以蛋白酶-白介素-1轉(zhuǎn)化酶(interleukin-1β-converting enzyme,ICE)組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。ICE可在天冬氨酸殘基之后將33KD的IL-1前體裂解為17．5KD的IL-1β，屬于ICE蛋白酶超家族。
目前已發(fā)現(xiàn)13個(gè)成員，根據(jù)其序列同源性分為3個(gè)亞家族：ICE-樣、ICE-1樣和CPP32樣蛋白酶。它們具有保守的底物結(jié)合和酶促序列，在天冬氨酸后將底物降解，故該酶現(xiàn)被稱(chēng)為半胱天冬蛋白酶(cysteine apartate-specific proteinase,caspase)，并把上述三個(gè)亞家族分別稱(chēng)為caspase-1、caspase-2和caspase-3亞家族。它們的過(guò)度表達(dá)將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[6]。
張金濤等[7]利用S-P免疫組化法發(fā)現(xiàn)，前腦IRI后1 d，大鼠海馬CA1、CA4區(qū)出現(xiàn)明顯的ICE免疫陽(yáng)性反應(yīng)，第3天達(dá)高峰，第5天后明顯減少；腦皮質(zhì)也呈現(xiàn)出與海馬區(qū)類(lèi)似的現(xiàn)象，ICE免疫陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞散在分布。與此相反，丹參組ICE的表達(dá)明顯減少，特別是大腦皮層區(qū)和海馬CA1區(qū)。因此，作者認(rèn)為ICE在腦缺血中可能發(fā)揮重要的凋亡調(diào)節(jié)作用；丹參能下調(diào)腦缺血區(qū)ICE表達(dá)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。
2．2 阻斷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
大多數(shù)情況下，來(lái)自于細(xì)胞外的誘導(dǎo)因素，如自由基、細(xì)菌、病毒等作用于細(xì)胞后轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡信號(hào)，并通過(guò)胞內(nèi)不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑最終激活細(xì)胞死亡程序，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是連接凋亡誘導(dǎo)因素與核DN段化斷裂及細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白降解的中間環(huán)節(jié)[6]。丹參經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，可干預(yù)下列已知的凋亡相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而實(shí)現(xiàn)其抗凋亡作用。
2．2．1 死亡因子及其受體介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
腫瘤壞死因子(TNF)家族中的TNF、Fas 配體、TNF-相關(guān)凋亡誘導(dǎo)性配體(TNF-related apoptosis inducing ligand,TRAIL或 Apo2L)和Apo3L能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此被稱(chēng)為死亡因子[6]。介導(dǎo)它們誘導(dǎo)凋亡的受體為死亡受體。在體內(nèi)，TNF主要由巨噬細(xì)胞(Mφ)分泌。大量體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，丹參不僅可有效抑制Mφ分泌TNF-α，還可以在基因水平抑制TNF-α在肝、腎、心等組織中的蛋白表達(dá)[8,9,10,18]。所以，丹參可能通過(guò)抑制TNF-α的生成和釋放，減少I(mǎi)RI時(shí)細(xì)胞凋亡。但其具體受體后途徑是抑制NF-κB還是JNF/AP-1則目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。
2．2．2 第二信使鈣誘導(dǎo)的凋亡
Ca2+是細(xì)胞凋亡發(fā)生過(guò)程中重要的信息分子。［Ca2+］i持續(xù)升高可使核酸內(nèi)切酶激活，DN段化。應(yīng)用膜聯(lián)蛋白熒光素(Annexin-V-Fluos)、碘化丙啶(PI)雙標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)、全細(xì)胞膜片鉗放大系統(tǒng)顯微熒光測(cè)定術(shù)同步觀察H2O2誘導(dǎo)人類(lèi)肝細(xì)胞(LO2細(xì)胞)、內(nèi)皮細(xì)胞(EVC304)凋亡時(shí)不同時(shí)限Ca2+流變化和丹參提取物Rxa的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)：①H2O2作用后0．5 h即出現(xiàn)Ca2+躍升現(xiàn)象；當(dāng)［Ca2+］i>400 nmol/L后1 h出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡膜翻轉(zhuǎn)現(xiàn)象，即磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)層轉(zhuǎn)移到外層；此后，［Ca2+］i持續(xù)升高，早期凋亡細(xì)胞(Annexia-V+)、死亡細(xì)胞(PI+)指數(shù)均上升；熒光顯微鏡下出現(xiàn)大量綠色熒光的早期凋亡細(xì)胞和胞漿或胞核紅染的死亡細(xì)胞。同時(shí)［Ca2+］i上升了一個(gè)數(shù)量級(jí)；②在Rax處理組H2O2作用8 h后［Ca2+］i尚未超過(guò)400 nmol/L，與對(duì)照組比較差異顯著(P400 nmol/L很可能是細(xì)胞凋亡啟動(dòng)的早期信號(hào)。Rax有效阻抑了第二信使Ca2+跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，由此可能減少其在核內(nèi)促進(jìn)凋亡基因信號(hào)傳遞中的作用及其后引起的細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷。分析其機(jī)理可能是：①作為咖啡?？s酚酸衍生物之一的Rax富含酚羥基，可和H2O2發(fā)生氧化反應(yīng)，接受O-生成羧基-COOH，從而直接減輕H2O2對(duì)細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜的損傷，減少Ca2+經(jīng)細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滲漏入細(xì)胞內(nèi)；②因肝細(xì)胞Ca2+內(nèi)流由鈣-鈣調(diào)蛋白復(fù)合物和IP3敏感鈣池共同調(diào)節(jié)。故Rax對(duì)LO2極顯著的Ca2+阻滯作用可能是直接作用于鈣-鈣調(diào)節(jié)蛋白受體，阻止受體操縱性鈣通道開(kāi)放所致[11]。
2．2．3 由線粒體損傷后啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡 新近的研究證實(shí)，由活性氧(ROS)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載或缺血缺氧等病理因素也是誘發(fā)細(xì)胞凋亡的重要觸發(fā)機(jī)制[11,12]。當(dāng)這些死亡信號(hào)到達(dá)線粒體后，首先引起線粒體滲透性轉(zhuǎn)換并釋放凋亡相關(guān)蛋白，包括細(xì)胞色素C(cyt-C)及caspase-3等，cyt-C而后參與激活凋亡激活因子與caspase-9的結(jié)合及caspase-9的激活，后者繼而激活caspase-3，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。IRI時(shí)ROS生成過(guò)多，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，線粒體受損，誘導(dǎo)細(xì)胞過(guò)度凋亡[6]。丹參具有強(qiáng)大的清除自由基、減輕鈣超載、保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)和功能的完整等作用，因而可切斷上述誘導(dǎo)因素的產(chǎn)生，阻斷了此通路啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡[13-15,17]。
2．3 調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因表達(dá)
細(xì)胞凋亡是級(jí)聯(lián)式基因表達(dá)的結(jié)果。目前已知細(xì)胞凋亡相關(guān)基因多達(dá)數(shù)十種，根據(jù)功能不同分為三類(lèi)：抑制凋亡基因，如EIB、ZAP、Bcl-2，其中對(duì)Bcl-2的研究最為詳細(xì)而系統(tǒng)；促進(jìn)凋亡基因，如Fas、Bax、ICE、P53等；雙向調(diào)控基因，如J-myc、Bcl k等。正常情況下，促進(jìn)凋亡基因與抑制凋亡基因處于協(xié)調(diào)的對(duì)立統(tǒng)一狀態(tài)，IRI時(shí)這種平衡被打破，組織細(xì)胞凋亡增多[2]。
張金濤等[7]報(bào)道BcL-2在前腦缺血2 h就有表達(dá)，于6 h達(dá)高峰，其后減少。此變化以海馬CA1區(qū)最為顯著。說(shuō)明BcI-2主要在細(xì)胞凋亡早期發(fā)揮作用。丹參在缺血30 min給予后，BcL-2的表達(dá)明顯增加。趙明中等[15]采用心肌IRI模型，以TUNEL及S-P免疫組化法進(jìn)一步證實(shí)復(fù)方丹參滴丸不僅可以使BcL-2蛋白的陽(yáng)性表達(dá)數(shù)(PEI)明顯增加，還可使心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)及Fas蛋白PEI下降。且隨著復(fù)方丹參滴丸的劑量加大而進(jìn)一步降低(P
綜上所述，丹參作用廣泛，對(duì)IRI細(xì)胞凋亡各環(huán)節(jié)都有調(diào)節(jié)作用，從細(xì)胞、分子及基因水平阻斷了IRI發(fā)生發(fā)展過(guò)程中因細(xì)胞凋亡引起的一系列“惡性循環(huán)”，從而表現(xiàn)出對(duì)IRI顯著的保護(hù)作用。因此，丹參對(duì)減輕IRI來(lái)說(shuō)是一種十分理想的藥物，在臨床上具有廣闊的應(yīng)用前景；同時(shí)丹參的抗凋亡作用也為臨床上治療因凋亡過(guò)度引起的疾病提供了一條新思路。
參考文獻(xiàn)
1 冷靜,彭韜,馮振卿,等.大鼠缺血再灌注后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的研究.江蘇醫(yī)藥,1998，24(12):865.
2 趙明中,陳運(yùn)貞,李媛媛,等.大鼠心肌再灌注時(shí)心肌細(xì)胞的凋亡、Fas基因表達(dá)及缺血預(yù)處理對(duì)其影響.中華內(nèi)科雜志,1999，38(11):753.
3 陳敏，郭仁壽，陳重義，等.腎缺血再灌注損傷中氧自由基與細(xì)胞凋亡.實(shí)用兒科臨床雜志,1999，14(5):283.
4 廖洪軍，陳香美，崔世維，等.缺血性腎損傷中細(xì)胞凋亡的初步觀察.中華醫(yī)學(xué)雜志,1994，74(10).620.
5 Wu W,Kuang P,Li Z.Protective effect of radix salviae miltiorrhizae on apoptosis of neurones during focalcorebral ischemia and reperfusion injury.J Tradit Chin Med,1997，17(3):220.
6 吳其文，余應(yīng)年，盧建.新編病理生理學(xué).中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,1999:69.
7 張金濤,李義召,趙書(shū)平,等.腦缺血再灌注后ICE、BcI-2的表達(dá)及丹參的神經(jīng)保護(hù)作用研究.卒中與神經(jīng)疾病,2001,8(1):26.
8 王文俊,吳咸中,姚智,等.大黃素、丹參素對(duì)單核細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子的調(diào)節(jié).中國(guó)免疫學(xué)雜志,1995,11(6):370.
9 虎曉岷,尹文,梁繼何,等.丹參對(duì)創(chuàng)傷性急性肺損傷治療作用的實(shí)驗(yàn)研究.中國(guó)危重病急救醫(yī)學(xué),2000,12(9):515.
10 王文俊,吳咸中,姚智,等.丹參素對(duì)單核I巨噬細(xì)胞功能影響的體外實(shí)驗(yàn).實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合雜志,1995,8(7):390.
11 盧綺平,田磊,吳在德.H2O2誘導(dǎo)人類(lèi)肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡時(shí)Ca2+流變化的對(duì)比研究.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,1999,16(2):147.
12 Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease.science,1995,267:1456.
13 閻福嶺,王建平,韓雄,等.兔缺血腦組織病理改變光量子液療的影響.中國(guó)急救醫(yī)學(xué),1998,18(5):9.
14 中國(guó)科學(xué)院藥物研究所.中草藥現(xiàn)代研究.北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1996:509.
15 柯示勝,趙振東.鼠缺血心肌細(xì)胞跨膜信息傳遞功能及藥物干預(yù)的影響.天津醫(yī)學(xué),1996,24(12):715.
16 趙明中,王家瑞,魏嘉平,等.復(fù)方丹參滴丸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注時(shí)心肌細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志,1999,15(4):288.